- Cấu trúc của lignocellulose 1.1.1. - Cấu trúc thành tế bào thực vật Trong tự nhiên, các lớp của thành tế bào thực vật được minh họa bằng mô hình của gỗ (Hình 1.1). - Ở giữa các tế bào, có một hợp chất đóng vai trò như keo dán gắn kết các tế bào lại với nhau, đó là lớp gian bào (middle lamella). - Bên trong là thành tế bào sơ cấp (primary wall). - Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37] Thành tế bào sơ cấp có thể được chia thành mặt bên trong và mặt bên ngoài. - Sự sắp xếp của các vi sợi trong thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt trong ra mặt ngoài. - Tiếp đến là thành tế bào thứ cấp gồm 3 lớp: lớp ngoài (S1), lớp giữa (S2) và lớp trong (S3). - Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu là do sự định hướng khác nhau của các vi sợi trong ba lớp đó. - Điển hình các vi sợi định hướng xoắn trong vách tế bào. - Lớp ngoài của thành tế bào thứ cấp, các vi sợi được định hướng trong cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành một góc lớn với trục dọc của tế bào. - Lớp giữa là lớp dày nhất và ở lớp giữa có góc nhỏ và độ nghiêng của sợi xoắn ốc trong khi vi sợi trong lớp 3 được sắp xếp như ở lớp ngoài, với một góc rộng với trục dọc của tế bào. - Ngoài ra trong một số trường hợp, trên mặt trong của thành tế bào có lớp sần sùi (W). - Chức năng của thành tế bào là chống đỡ cho các cơ quan của cây đặc biệt là các vách dày và cứng. - Thành tế bào còn giữ các chức năng quan trọng chính như hấp thụ, thoát hơi nước hay vận chuyển và bài tiết. - Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố. - Hình 1.2: Thành phần chủ yếu của lignocellulose Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9] Nguồn lignocellulose. - Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [15].. - Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%).. - Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. - Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. - Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [40]. - Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 1.4 [29].. - Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. - Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. - Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [2]. - Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1( 4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. - Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng. - Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. - Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose.. - Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. - Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. - Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. - Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. - Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ. - Lignin không phải là carbohydrate nhưng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nước trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nước), giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh. - Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn. - Hơn nữa, lignin đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết, để rồi đóng góp một phần lớn chất mùn giúp tăng khả năng quang hợp của thực vật. - Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. - Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. - Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin [14] Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ. - Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc. - Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. - Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô định hình. - Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào. - Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhưng không nhiều). - Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên kết [2]. - Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose. - Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. - Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoside (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin) Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. - Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C [29]. - Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. - Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các carbohydrate khác bị bẻ gãy. - Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(1(4). - Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1(4. - Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3. - Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. - Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân.. - Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính. - Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực vật. - Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong liên kết glycoside. - Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc. - Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó.. - Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ, v.v… Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. - Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác [32]. - Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau. - Hình 1.7: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng. - Hình 1.8: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm 1.2. - Enzyme thủy phân lignocellulose. - Trong tương lai gần, các quy trình sử dụng enzyme thủy phân lignocellulose hoặc dựa vào vi sinh vật có thể mang lại cho chúng ta nhiều lợi ích lớn và thân thiện với môi trường. - Mối quan hệ giữa cellulose và hemicellulose trong thành tế bào ở thực vật bậc cao chặt chẽ hơn chúng ta tưởng trước đó. - Đó có thể là do các phân tử tại các liên kết cellulose-hemicellulose hoặc tại các vùng cellulose tinh thể đòi hỏi phải có các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn. - Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau. - Nếu đúng như vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích được tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose. - Các chủng này sẽ đóng vai trò như trung tâm thủy phân polymer để tạo ra đường và các sản phẩm thủy phân khác.. - Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác. - Thí dụ như từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng như ethanol [12]. - Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1(4) glucoside. - Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei [36], hệ enzyme thủy phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình 1.9):. - Enzyme nội bào endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. - Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận. - Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose. - Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 1.2.2. - Enzyme xylanolytic Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp. - Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic) (Hình 1.10). - Như vậy, sự phân giải polysaccharide phức tạp như vậy có thể gồm hoạt động hỗ trợ giữa các thành phần khác nhau của hệ thống enzyme xylanolytic [7].. - Hình 1.10: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan. - EC 3.2.1.37) là enzyme ngoại bào exoglyosidase thủy phân các oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose. - Hầu hết các β-xylosidase được nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế bởi xylose sản phẩm thủy phân của chúng. - Mặc dù enzyme arabinosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân xylan, chỉ có một vài enxyme đã được cô lập và mô tả. - α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3- và 1,5-α-L-arabinofuranosyl trong arabinoxylolan đã được báo cáo trong A. - Khi giải phóng arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra xylooligosaccharide. - Enzyme này không tác động đối với α-L-1,3 hoặc α-1,5 liên kết arabinose từ arabinan, arabinogalactan, hoặc p-nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranoside. - α-Glucuronidase α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axit glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan. - Esterase acetylxylan Enzyme esterase acetylxylan là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [8]. - Trong thập kỷ qua, enzyme thủy phân lignocellulose ngày càng được quan tâm. - Hàng năm, lượng lignocellulose do thực vật tổng hợp nên là 1011 tấn. - Ứng dụng trong quá trình thủy phân gỗ và phế liệu gỗ rẻ tiền thành các đường đơn giản rồi có thể chế biến thành thức ăn cho gia súc. - Các nguyên liệu thực phẩm có nguồn gốc thực vật nếu được gia công bằng chế phẩm enzyme cellulase và xylanase sẽ được mềm ra, tăng hệ số đồng hóa và chất lượng. - Ứng dụng trong quá trình thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác. - Thí dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng như ethanol