- 2 Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã đề cập đến sự đa dạng di truyền của các DENV và mối liên quan giữa các biến thể di truyền với độc lực virus. - Tại Việt Nam, SXHD đã trở thành dịch hàng năm và cả 4 typ DENV đã được xác định cùng lưu hành gây bệnh. - Typ DEN - 1 đã được xác định là căn nguyên gây bệnh chính trong vụ dịch này. - 8 Để tìm hiểu đặc điểm gen di truyền của các chủng DEN - 1 trong vụ dịch năm 2017 và mối liên quan với các mức độ nặng trên lâm sàng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu mô tả đặc điểm sinh học phân tử và mối liên quan với lâm sàng. - Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học phân tử và mối liên quan với mức độ lâm sàng của DEN - 1 gây dịch năm 2017. - Nghiên cứu đa trung tâm, từ gồm 188 bệnh nhân sốt xuất huyết dengue (SXHD). - Đã giải mã thành công hệ gen của 55 chủng DEN - 1 gây dịch năm 2017. - Các chủng DEN - 1 đều thuộc genotype 1 và có mức độ biến đổi axit amin cao ở hầu hết các gen (4,6. - Có mối liên quan giữa bốn vị trí biến đổi axit amin 67, 126 (NS2A). - Nghiên cứu làm sáng tỏ nguồn gốc, sự biến đổi di truyền của các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Việt Nam và mối liên quan giữa các vị trí thay thế axit amin với mức độ lâm sàng.. - Từ khóa: Hệ gen, dengue virus type 1 (DEN - 1), biến đổi axit amin.. - của typ DEN - 1 gây dịch năm 2017”.. - Tiêu chuẩn loại trừ: Mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân đang mắc các bệnh cấp tính khác hoặc bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.. - Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành từ tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (BVNĐTƯ) và bệnh viện Bệnh Nhiệt đới - TP.. - Thiết kết nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả, đa trung tâm. - nhập viện trong 3 ngày đầu của bệnh sẽ được chọn vào nghiên cứu. - Để xác định các biến đổi axit amin, mối quan hệ di truyền của các chủng DEN - 1 gây bệnh trong vụ dịch năm 2017 và xây dựng cây phát sinh loài, chúng tôi giải trình tự toàn bộ hệ gen của 55 chủng DEN - 1 có tải lượng virus >. - Để làm tham chiếu chúng tôi cũng tiến hành giải trình tự hệ gen của 18 chủng DEN - 1 (gồm 9 chủng gây bệnh năm 2015 và 9 chủng năm 2016).. - Toàn bộ bệnh nhân tham gia nghiên cứu. - Các quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu. - Giải trình tự toàn bộ hệ gen được thực hiện trên hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới (NGS - Next Generation Sequencing) MiSeq của hãng Illumina. - 9 Trình tự bộ gen virus được lắp ráp từ các đoạn đọc bằng phần mềm CLC, sử dụng trình tự tham chiếu là chủng DEN - 1 năm 1997 (GenBank NC_001477.1). - Phân tích sự biến đổi axit amin thông qua so sánh trình tự axit amin của 55 chủng DEN - 1 năm 2017 với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Việt Nam (các năm . - Chúng tôi cũng so sánh với các chủng DEN - 1 gây bệnh ở một số nước trong khu vực và trên thế giới. - Phân tích biến đổi di truyền của các chủng DEN - 1 bằng phần mềm MEGA (6.06) và ClustalX 2.1.. - Tính khoảng cách hệ gen và so sánh độ tương đồng hệ gen giữa các chủng nghiên cứu và các chủng tham chiếu (47 chủng từ ngân hàng gen) được thực hiện bằng phương pháp MASH 2.0, sau đó vẽ biểu đồ Heatmap.. - Xây dựng cây phát sinh loài: Trình tự hệ gen của 55 chủng DEN - 1 và 47 chủng tham chiếu (từ ngân hàng gen) được so sánh bằng phần mềm MAFFT (Multiple Alignment using Fast Fourier Transform). - Toàn bộ trình tự đa hình. - Các kỹ thuật sinh học phân tử được thực hiện tại - BVNĐTƯ, phối hợp với đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học Oxford tại Việt Nam.. - Các test Pearson Chi - Square và Fisher’s Exact Test được sử dụng trong nghiên cứu.. - Đạo đức nghiên cứu. - Nghiên cứu được thông qua Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương, số 23/. - KẾT QUẢ. - Giải trình tự hệ gen DEN - 1 và phân tích các biến đổi axit amin. - Mức độ biến đổi axit amin trên hệ gen của các chủng DEN - 1 Protein/gen Số acid amin biến đổi/ tổng số Tỉ lệ biến đổi. - Kết quả giải trình tự hệ gen cho thấy, 55 chủng DEN - 1 được giải trình tự thành công toàn bộ hệ gen với độ tin cậy cao, hệ gen mã hóa 10 protein (cấu trúc và không cấu trúc) được đọc lặp lại trung bình từ 300 lần - 20.000 lần. - Kết quả giải trình tự hệ gen đã xác định kích thước bộ gen hoàn chỉnh của các chủng DEN - 1 gồm 10.697 nucleotide và mã hóa một khung đọc mở gồm 3392 axit min (aa).. - Kết quả phân tích hệ gen của 55 chủng DEN1 đã cho thấy biến đổi axit amin được phát hiện trên tất cả các gen (10 gen) thuộc vùng mã hóa. - Tỉ lệ thay thế các axit amin tính chung trên toàn hệ gen là 4,6%, sự đa dạng axit amin thấp nhất trên gen NS4B (1,6%) và cao nhất trên gen NS2A (11,0%) (Bảng 1). - Tỉ lệ các chủng có biến đổi axit amin trên các gen dao động từ 1 - 6 chủng và tập trung. - So sánh độ tương đồng các vị trí biến đổi axit amin cho thấy, 55 chủng DEN - 1 năm 2017 có độ tương đồng cao với các chủng DEN - 1 gây bệnh năm được giải trình tự gen đồng thời) và năm 2008 tại Việt Nam.. - Nhưng có sự khác biệt tại hầu hết các gen, ở nhiều vị trí axit amin, so với chủng DEN - 1 gây bệnh tại Việt Nam năm 2005.. - Sự tương đồng trình tự bộ gen các chủng DEN - 1. - Phân cụm bộ gen của các chủng DEN - 1 năm 2017 (D1) và các chủng tham chiếu dựa trên khoảng cách MASH. - Biểu đồ Heatmap minh họa sự tương đồng theo cặp giữa các chủng D1 và các chủng tham chiếu dựa trên thang màu nằm trong khoảng từ 0 (màu xanh) đến 0,1 (màu đỏ). - các mẫu D1 với mẫu tham chiếu, mức độ tương đồng hệ gen lớn. - Nhóm 2 là màu cam và đỏ thể hiện khoảng cách giữa các mẫu lớn, mức độ tương đồng hệ gen nhỏ.. - Từ các dải màu xanh tới màu vàng và màu đỏ biểu thị sự tăng dần về giá trị khoảng cách bộ gen giữa các chủng DEN - 1 (của nghiên cứu và các chủng tham chiếu). - Nhóm 1 gồm toàn bộ vùng màu xanh biểu thị khoảng cách nhỏ (giữa các chủng DEN - 1 năm 2017 với chủng tham chiếu), do đó giữa các chủng có mức độ tương đồng bộ gen lớn. - Ngược lại, nhóm màu cam và màu đỏ, thể hiện khoảng cách giữa các chủng là rất lớn, do đó độ tương đồng về bộ gen giữa các chủng nhỏ. - Biểu đồ Heatmap cũng chỉ ra, trình tự hệ gen của các chủng DEN - 1 gây bệnh năm 2017 và các chủng gây bệnh năm gần như trùng. - khớp với trình tự của các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Việt Nam năm màu xanh đậm), cũng như có độ tương đồng cao với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Campuchia năm . - Các chủng năm 2017 có độ tương đồng trình tự hệ gen thấp so với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Nhật Bản và Myanmar (màu vàng). - Ngoài ra, trình tự hệ gen còn có sự khác biệt khá lớn với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Brunei và Singapore (màu đỏ cam), mặc dù các chủng này cùng gây bệnh trong khu vực Đông Nam Á.. - Cây phát sinh loài của các chủng DEN1. - Các chủng trong nghiên cứu được ký hiệu là DENV1, các chủng gây bệnh tại Việt Nam trước đây và. - trên thế giới được ký hiệu bằng tên nước, số gia nhập GenBank và năm gây bệnh.. - Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự nucleotide của toàn bộ hệ gen DEN - 1, bao gồm 55 chủng (gây dịch năm 2017), 18 chủng (năm và 47 chủng tham chiếu từ ngân. - Các chủng trong nghiên cứu được đánh số từ 1 - 55, các chủng năm và các chủng tham khảo từ ngân hàng gen ký hiệu lần lượt từ 56 đến 120. - Kết quả phân tích cho thấy, 55 chủng DEN - 1 gây bệnh năm 2017 có sự đồng nhất, không có sự pha trộn về nguồn gen và đều thuộc genotype 1. - Các chủng này có mức tương đồng trình tự hệ gen rất cao với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Việt Nam trong các năm cũng như có mối quan hệ di truyền gần với các chủng gây bệnh tại Campuchia (năm . - Kết quả cũng chỉ ra, 55 chủng DEN - 1 năm 2017 cùng nhóm với các chủng DEN - 1 gây bệnh trong khu vực, như Việt Nam Campuchia Thailand Myanmar (2002), Malaysia (2005), nhưng không cùng nhóm với các chủng gây bệnh tại Mỹ, Brazil, Mexico, Argentina, Venezuela, Comlombia. - Tuy cùng một khu vực địa lý, nhưng các chủng DEN - 1 gây bệnh năm 2017 có sự khác biệt lớn với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Singapore (2013), Myanmar (1976), Malaysia (1972), Trung Quốc (2006), Indonesia (1998) và Brunei (2006) (Hình 2).. - Đối chiếu phân loại lâm sàng SXHD với mức độ biến đổi axit amin. - Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân SXHD theo tải lượng virus và mức độ biến đổi axit amin. - aa biến đổi. - Chúng tôi chọn ra 14/157 vị trí axit amin có tỉ lệ biến đổi cao, đại diện cho 10 gen vùng mã hóa, để. - Kết quả cho thấy, 6/14 vị trí thay thế axit amin có liên quan với phân loại lâm sàng nặng và không nặng (khác biệt có ý nghĩa thống kê, p. - Các vị trí biến đổi axit amin có liên quan với sự khác biệt trên lâm sàng là 125 (PrM). - Trong vụ dịch năm 2017 có sự lưu hành đồng thời của hai typ DEN - 1 và DEN - 2, tuy nhiên typ DEN - 1 vẫn là typ virus đóng vai trò gây bệnh chính (chiếm 98,3%) trong vụ dịch này. - 8 Các kết quả giám sát virus học trong gần hai thập kỷ qua cũng ghi nhận DEN - 1 và DEN - 2 vẫn là hai typ virus gây bệnh chiếm ưu thế, trên toàn bộ lãnh thổ Việt Nam. - 7,10 Hơn thế nữa, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy kể từ năm 2010 đến nay, tỉ lệ lưu hành của typ DEN - 1 có xu hướng tăng dần qua các vụ dịch tại Việt Nam. - 6,10 Trong vụ dịch SXHD năm 2017 kết quả nghiên cứu của chúng tôi (trên hai miền Bắc và Nam) cho thấy typ DEN - 1 chiếm ưu thế (98,3%) hơn hẳn các typ khác. - Vì vậy, việc nghiên cứu về sinh học phân tử của typ DEN - 1 có thể có ích trong đánh giá về mức độ ảnh hưởng của DEN - 1 đến vụ dịch 2017.. - 12 Chúng tôi đã tiến hành phân tích hệ gen của 55 chủng DEN - 1 gây dịch năm 2017. - Kết quả cho thấy tỉ lệ biến đổi các axit amin trên toàn bộ hệ gen cao hơn (4,6%) (Bảng 1), nếu so với kết quả phân tích trong các vụ dịch trước đây (chỉ dao động từ 2,4% đến 3,7. - dịch SXHD năm 2017.. - Tuy nhiên khi so sánh về độ tương đồng các điểm biến đổi axit amin giữa các chủng trong vụ dịch năm 2017 với các chủng tham khảo, chúng tôi nhận định các chủng DEN - 1 gây bệnh năm 2017 có thể vẫn là các chủng gây bệnh năm và có chung nguồn gốc với các chủng DEN - 1 gây bệnh tại Việt Nam năm 2008, nhưng không chung nguồn gốc với chủng gây bệnh tại Việt Nam năm 2005. - Chúng tôi cũng so sánh với các chủng DEN - 1 gây bệnh ở một số nước trong khu vực như Thái Lan (2010), Campuchia (2008), Trung Quốc (2017) và Brazil (2010) là một khu vực có khoảng cách địa lý cách xa Việt Nam. - Kết quả cho thấy cũng có sự tương đồng nhất định ở các vị trí thay thế axit amin.. - Bản đồ heatmap đã cho thấy mối quan hệ di truyền giữa 55 chủng DEN - 1 gây bệnh năm 2017 với các chủng tham chiếu. - Số liệu phân tích đã chứng minh các chủng DEN - 1 năm 2017 (Hình 1) có độ tương đồng về bộ gen rất cao với các chủng DEN - 1 năm và các chủng gây bệnh tại Việt Nam năm . - Ngoài ra, các chủng này cũng có mối quan hệ di truyền gần gũi với các chủng gây bệnh tại Campuchia . - Như vậy, các chủng DEN - 1 năm 2017 vẫn là các chủng nội địa.. - Toàn bộ 55 chủng DEN - 1 trong nghiên cứu, 18 chủng tham chiếu năm và các chủng gây bệnh năm được xếp cùng một nhánh riêng biệt trên cây phát sinh loài, đều được xác định thuộc genotype 1 (Hình 2). - Điều đó cũng khẳng định thêm các chủng DEN - 1 gây dịch năm 2017 là các chủng lưu hành và gây bệnh tại Việt Nam. - Các chủng DEN - 1 năm 2017 cũng có chung nguồn gốc với các chủng gây bệnh tại Campuchia . - Như vậy, các chủng DEN - 1 đã trở thành chủng lưu hành đặc hữu tại Việt Nam và ít có. - 13 Khi đối chiếu 14 vị trí axit amin có tỉ lệ biến đổi cao với lâm sàng, chúng tôi ghi nhận 6/14 vị trí biến đổi trên hệ gen của các chủng DEN - 1 có liên quan với biểu hiện lâm sàng nặng và không nặng. - Cụ thể, trên những bệnh nhân được phân loại SXHD nặng có sự thay đổi 67,6% các axit amin tại các vị trí 67, 126 (NS2A). - Ngược lại, trong SXHD không nặng chỉ có sự thay đổi 57,1% số axit amin tại các vị trí 125 (PrM). - Các nghiên cứu và Y văn cũng đã ghi nhận sự đa dạng biến đổi các vị trí axit amin có thể dẫn đến thay đổi khả năng gây bệnh và độc lực của DENV. - 4 Một số nghiên cứu cũng chỉ ra các biến đổi trên gen cấu trúc (PrM, E) và một số gen không cấu trúc (NS2B, NS3) có liên quan tới mức độ nghiêm trọng của bệnh. - 14,15 Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa đề xuất về các vị trí thay thế axit amin có liên quan với mức độ nặng trên lâm sàng. - Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về mối liên quan này, vì vậy cần có thêm các nghiên cứu trong tương lai.. - Qua kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử DENV gây dịch năm 2017, chúng tôi đưa ra kết luận DEN - 1 là typ virus chiếm ưu thế trong vụ dịch và các chủng gây bệnh có mức độ đa dạng di truyền cao. - Xét về nguồn gốc phát sinh loài, các chủng này vẫn là chủng lưu hành và gây bệnh tại Việt Nam. - Một số vị trí thay thế axit amin có liên quan tới SXHD nặng.. - Đặc điểm lâm sàng bệnh sốt xuất huyết dengue theo các typ virus dengue gây bệnh.. - Sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ các týp vi rút dengue gây bệnh sốt xuất huyết tại hà nội, giai đoạn