- ĐẶC TÍNH VI KHUẨN NỘI SINH PHÂN LẬP TRONG CÂY KHÓM TRỒNG TRÊN ĐẤT PHÈN VĨNH THUẬN,. - Một trăm lẻ ba dòng vi khuẩn được phân lập trong cây khóm trồng ở huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang trong đó có 85 dòng được xác định là vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 16S-rDNA. - Sử dụng phép thử sinh hóa đã xác định được 38/85 dòng vi khuẩn nội sinh có đủ 3 đặc tính tốt (cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA). - Tuy nhiên, khi giải trình tự đoạn gen 16S-rDNA của 3/38 dòng vi khuẩn này, xác định được dòng LK4 được phân lập trên môi trường LGI và dòng BK1 được phân lập trên môi trường BAz có tỉ lệ đồng hình của đoạn gen 16S-rDNA với loài Burkholderia tropica NR_028965 là 99,2%. - tỉ lệ đồng hình đoạn gen 16S-rDNA của dòng NK2 được phân lập trên môi trường NFb với loài Enterobacter hormaechei GQ 9006 là 99,6%. - Đề nghị đưa ba dòng vi khuẩn (LK4, NK2, BK1) có các đặc tính tốt này vào sản xuất phân sinh học bón cho cây trồng.. - Từ khóa: Cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan, Phân sinh học, sinh tổng hợp IAA, Vi khuẩn nội sinh. - Theo Zinniel et al (2002), vi khuẩn nội sinh được tìm thấy trong rất nhiều loại cây trồng ở Hoa Kỳ, vi khuẩn nội sinh là các vi khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ, thân và lá để sống bên trong các mô thực vật mà không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với cây chủ;. - Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sự sinh trưởng của cây bằng cách tổng hợp kích thích tố auxin (IAA) (Barbieri et al., 1986), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng nhiều nguồn bệnh khác nhau của cây (Fashey et al., 1991. - Những thí nghiệm trước đây đã phát hiện vi khuẩn Azospirillum lipoferum trong cây lúa mùa đặc sản ở ĐBSCL (Cao Ngọc Điệp et al., 2007), trong cây cỏ chăn nuôi (Nguyễn Thị Thu Hà et al., 2009). - Để tiến tới một nền nông nghiệp bền vững với một sản phẩm đạt tiêu chuẩn Global-GAP, cây khóm trồng trên đất phèn như vùng đất Vĩnh Thuận, Kiên Giang cần được nghiên cứu những vi khuẩn nội sinh, xác định và đánh giá một số đặc tính tốt như cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan, sinh tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh này để ứng dụng những vi khuẩn nội sinh tốt cho cây trồng nói chung và cây khóm nói riêng như là dạng phân sinh học trong tương lai.. - 2.2 Phân lập vi khuẩn. - Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, 200 μl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần cuối được chủng lên các đĩa môi trường tryptone – yeast extract – glucose – agar và ủ ở 30ºC, nếu sau 24h ủ các đĩa môi trường này không có các khuẩn lạc xuất hiện thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu. - Lấy 200 μl dịch mẫu nghiền cho vào các ống nghiệm chứa 3 ml môi trường LGI (Cavalcante và Dobereiner, 1988), Nfb (Krieg và Döbereiner, 1984) và BAz bán đặc (Santos et al., 2001) rồi đem ủ ở 30ºC trong 2 - 3 ngày. - Sau 2 - 3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc LGI, Nfb và BAz đã chủng dịch trích của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng cách mặt môi trường nuôi khoảng 0,5 cm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.. - Lấy một ít vi khuẩn từ các màng mỏng của các môi trường bán đặc LGI, Nfb và BAz lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường LGI, Nfb và BAz đặc để tách dòng các khuẩn lạc. - Sau vài lần cấy chuyển trên các môi trường đặc, chọn các khuẩn lạc rời và đều nằm trên đường cấy quan sát dưới kính hiển vi. - Khi thấy vi khuẩn đã ròng (thuần nhất) thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để trữ ở 4ºC và được xem như là một dòng (chủng [isolate]).. - Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. - 2.3 Tách chiết DNA vi khuẩn. - Qui trình được thực hiện theo Nguyễn Thị Thu Hà et al. - Để nhận diện vi khuẩn sống nội sinh trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16S rDNA được thiết kế (Zinniel et al., 2002) với trình tự như đã trình bày theo Nguyễn Thị Thu Hà et al. - Vi khuẩn được nuôi trong môi trường Burk’s không có N đặc (Park et al., 2005) và định lượng ammonium hình thành trong mẫu bằng phương pháp Phenol Nitro- prusside sodium hypochloride để xác định hàm lượng NH 4 + được tạo ra bằng phản ứng so màu ở bước sóng 640 nm.. - Vi khuẩn được nuôi trong môi trường bổ sung 100 mg/l tryptophan và định lượng bằng thuốc thử Salkowski R2 và phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm.. - Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) và định lượng lân hòa tan bằng thuốc thử acid ascorbic - ammoniummolypdate - potassium antinomol tartrate và phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm.. - Sử dụng đoạn mồi 1 p515FPL trong phản ứng PCR để nhận diện vi khuẩn nội sinh đã mô tả ở phần trên. - Sử dụng chương trình BLAST N và BioEdit để so sánh trình tự các đoạn DNA của 3 dòng vi khuẩn với trình tự DNA của bộ gen ở các loài vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh. - Vi khuẩn nội sinh ở cây khóm rất đa dạng, chúng có thể phân tán lên cả thân, lá, cuống và trái. - Qua các giai đoạn phân lập và tách ròng vi khuẩn từ các mẫu rễ, thân, lá, cuống và trái của cây khóm trồng ở những vùng đặc trưng của huyện Vĩnh Thuận – tỉnh Kiên Giang trên các môi trường LGI, NFb và BAz bán đặc và đặc đã thu được 103 dòng vi khuẩn khác nhau. - Trong đó có 29 dòng được phân lập trên môi trường LGI, 44 dòng được phân lập trên môi trường NFb, 30 dòng được phân lập trên môi trường BAz.. - Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có chung một đặc tính là sinh trưởng và phát triển ở điều kiện vi hiếu khí trong các môi trường bán đặc, chúng phát triển thành lớp màng mỏng cách mặt môi trường nuôi khoảng 2 – 5 mm. - Kết quả này phù hợp với báo cáo của Weber et al. - (1999), theo nghiên cứu của Perin et al. - (2006) thì lớp màng mỏng hình thành cách mặt môi trường là 4 mm, kết quả của Santos et al.. - (2009) thì lớp màng cách mặt môi trường từ 0,5 – 1 cm. - Lớp màng mỏng hình thành trong môi trường bán đặc này có màu hơi trắng hoặc hơi vàng (Perin et al., 2006. - Santos et al., 2001).. - Trong số 103 dòng vi khuẩn đã phân lập, số dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ là nhiều nhất (29 dòng. - trong đó có 08 dòng trên môi trường LGI, 13 dòng trên môi trường NFb và 08 dòng trên môi trường BAz) chiếm tỉ lệ 28,16%. - số dòng vi khuẩn được phân lập từ thân là 26 dòng (LGI: 08, NFb: 11, BAz: 07) chiếm tỉ lệ 25,24%. - số dòng vi khuẩn được phân lập từ lá là 15 dòng (LGI: 05, NFb: 07, BAz:. - số dòng vi khuẩn được phân lập từ cuống là 17 dòng (LGI:. - 05, NFb: 06, BAz: 06) chiếm tỉ lệ 16,5% và số dòng vi khuẩn được phân lập từ trái là 16 dòng (LGI: 03, NFb: 07, BAz: 06) chiếm tỉ lệ 15,53%. - Qua đó cho thấy vi khuẩn nội sinh tập trung chủ yếu ở rễ và thân. - (1999), Nguyễn Thị Thu Hà et al. - 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn nội sinh. - Santos et al., 2001). - Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có thể chuyển động được do có chiên mao. - Vi khuẩn có dạng que ngắn chiếm phần lớn trong tổng số 103 dòng vi khuẩn phân lập được, có 92/103 dòng vi khuẩn dạng que ngắn chiếm tỉ lệ 89,32%. - Vi khuẩn có dạng que dài chiếm số lượng rất ít, 11/103 dòng vi khuẩn dạng que dài chiếm tỉ lệ 10,68%.. - Hình 1: Dòng vi khuẩn BK1 (môi trường Baz) ở độ phóng đại 3.000 lần và dòng vi khuẩn NK2 (môi trường NFb) ở độ phóng đại 6500 lần. - 3.3 Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng 16S rDNA. - (2002), Nguyễn thị Thu Hà et al. - (2009), Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Ái Chi (2009), là các dòng vi khuẩn nội sinh, những dòng còn lại không có băng hoặc có băng không ở vị trí 900 bp thì không phải là vi khuẩn nội sinh.. - Hình 2: Phổ điện di DNA của các dòng vi khuẩn nội sinh M: thang chuẩn 100 bp, 1-15: là các dòng NK19, NK32, BK1, BK7, NK43, BK11, BK24, BK26, NK16, BK28, BK12,. - Trong số dòng vi khuẩn nội sinh đã nhận diện thì số dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ các môi trường như sau: có 28 dòng được phân lập trên môi trường LGI (LK1-LK10, LK12-LK27, LK29-LK30), 37 dòng được phân lập trên môi trường NFb (NK1, NK2, NK4, NK6, NK8-NK11, NK13-NK14, NK16-NK17, NK19, NK21-NK33, NK35-NK36, NK38-NK46) và 20 dòng còn lại được phân lập trên môi trường Baz (BK1-BK2, BK4-BK14, BK16-BK17, BK19, BK24- BK25, BK27-BK28). - Như vậy số lượng vi khuẩn nội sinh được tìm thấy khi phân lập trên môi trường NFb nhiều hơn so với số lượng vi khuẩn nội sinh được phân lập trên môi trường LGI và BAz, kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Weber et al. - 3.4 Một số đặc tính của một số dòng vi khuẩn nội sinh 3.4.1 Khả năng cố định đạm. - Khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường không đạm. - Tất cả 38 dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng tạo NH 4 + cấy trên môi trường Burk đặc (agar) không đạm ở 30ºC với kết quả thống kê của các dòng vi khuẩn được phân lập từ 3 môi trường LGI, NFb và BAz cụ thể như sau: 15/28 dòng vi khuẩn LK trên môi trường LGI, 12/37 dòng vi khuẩn NK trên môi trường NFb và 11/20 dòng vi khuẩn BK trên môi trường Baz trong đó dòng LK3 tạo ra nhiều ammonium nhất trong 15 dòng vi khuẩn LK với 4,77 mg/l. - 3,44 và 3,20 mg/l trái lại các dòng vi khuẩn NK và BK tổng hợp ít ammonium (<1 mg/l).. - Tất cả 38 dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng hòa tan lân khó tan trong môi trường NBRIP với dòng vi khuẩn NK2 hòa tan được nhiều lân hòa tan nhất (80,26 mg P 2 O 5 /l) trong khi đó các dòng vi khuẩn LK và BK hòa tan lân ít (<50 mg P 2 O 5 /l).. - Ba mươi tám dòng vi khuẩn nội sinh, nuôi trong các môi trường lỏng LGI (15 dòng), NFb (12 dòng) và BAz (11 dòng) (tương ứng với các môi trường phân lập của chúng) có bổ sung 100 mg tryptophan/l đều có khả năng tổng hợp IAA. - Trong đó các dòng vi khuẩn NK17 được nuôi trong môi trường NFb có khả năng tổng hợp IAA cao nhất (5,49 mg/l) trong khi đó các dòng vi khuẩn LK và BK tổng hợp IAA thấp hơn. - Trong Bảng 1 cho thấy trong từng loại môi trường phân lập có một vài dòng vi khuẩn nổi bật với 3 đặc tính tốt trong đó dòng LK4 (môi trường LGI), dòng NK2 (môi trường Nfb) và dòng BK1 (môi trường Baz) được chọn để giải trình tự đoạn DNA (900 bp) với mồi 1.. - 3.5 Nhận diện các dòng vi khuẩn LK4, NK2 và BK1 có các đặc tính tốt bằng phương pháp giải trình tự DNA 16S rDNA. - Tuy nhiên, khi so sánh trình tự của 3 dòng này cho thấy dòng LK4 và dòng BK1 có 3 vị trí không tương đồng với dòng vi khuẩn B. - tropica NR_028965 chuẩn, còn dòng NK2 hầu như các vị trí tương đồng với dòng vi khuẩn E. - Phân lập được 103 dòng vi khuẩn từ các mẫu rễ, thân, lá, cuống và trái của cây khóm, trong đó 85 dòng là vi khuẩn nội sinh (28 dòng được phân lập trên môi trường LGI, 37 dòng được phân lập trên môi trường NFb và những dòng còn lại được phân lập trên môi trường BAz) đã được nhận diện bằng kỹ thuật PCR, cho sản phẩm DNA có kích thước ở vị trí 900 bp so với thang chuẩn 100 bp.. - hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA của những dòng vi khuẩn nội sinh. - Dòng vi khuẩn. - Trong tổng số 85 dòng vi khuẩn được khảo sát, có 38 dòng đều hội tụ đủ 3 đặc tính tốt (cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan và tổng hợp kích thích tố IAA).. - Các dòng có các đặc tính tốt nhất được phân lập trên 3 môi trường này là LK4, NK2 và BK1. - Như vậy 38 dòng vi khuẩn này thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh kích thích sự sinh trưởng thực vật.. - Xác định được 3 dòng vi khuẩn nội sinh, kích thích sự sinh trưởng ở thực vật được phân lập trên cả 3 môi trường có trình tự đoạn gen 16S-rDNA lần lượt tương đồng như sau: dòng LK4 được phân lập trên môi trường LGI có trình tự gen 16S- rDNA tương đồng 99,2% với loài Burkholderia tropica NR_028965. - dòng NK2 được phân lập trên môi trường NFb có tỉ lệ đồng hình với đoạn gen 16S-rDNA của loài Enterobacter hormaechei GQ 9006 là 99,6% và dòng BK1 được phân lập trên môi trường BAz có tỉ lệ đồng hình với trình tự gen 16S-rDNA của loài Burkholderia tropica NR_028965 là 99,4%.. - Đề nghị tiến hành đánh giá ngoài đồng những dòng vi khuẩn nội sinh đã định danh nhiều lần ở những vùng đất khác nhau trước khi ứng dụng vào việc sản xuất phân sinh học để bón ngược lại cho khóm ở những vùng đất nghèo chất dinh dưỡng.. - Nghiên cứu và sử dụng nguồn vi khuẩn nội sinh tốt làm phân sinh học để ứng dụng bón cho những đối tượng khác có giá trị về mặt kinh tế như: lúa, cây ăn trái,…. - Khảo sát những đặc điểm tốt (cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA) của những dòng còn lại và giải trình tự đoạn 16S-rDNA của một số dòng vi khuẩn này để định danh và tìm hiểu sự phong phú, đa dạng của chúng, nhằm mục đích hướng tới nghiên cứu sự đa dạng sinh học (biodiversity) của nhóm vi khuẩn nội sinh ở vùng ĐBSCL.. - Phát hiện vi khuẩn. - Azospirillum lipoferum nội sinh trong cây lúa mùa đặc sản (Oryza sativa L.) trồng ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. - Tomasino et al. - Murray et al., pp.94 – 103.. - Phân lập và đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi