- ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN ACID LACTIC PHÂN LẬP TỪ SỮA MẸ VÀ PHÂN TRẺ EM. - Bacteriocin, Enterococcus faecalis, kháng khuẩn, vi khuẩn acid lactic.. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát khả năng đối kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh của các dòng vi khuẩn acid lactic được phân lập từ sữa mẹ và phân trẻ em. - Ba mươi dòng vi khuẩn acid lactic được phân lập trên môi trường MRS-Cys, trong đó có 13 dòng được phân lập từ sữa mẹ và 17 dòng được phân lập từ phân trẻ em. - Kết quả khảo sát khả năng đối kháng bằng phương pháp nhỏ giọt cho thấy tất cả 30 dòng vi khuẩn phân lập đều kháng lại 4 vi khuẩn chỉ thị là Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerigunosa và Aeromonas hydrophila. - Chỉ có một dòng vi khuẩn HF4.2 có khả năng kháng lại nấm Candida albicans. - Kết quả khảo sát khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của bacteriocin từ các dòng vi khuẩn acid lactic cho thấy có 11/30 dòng ức chế Escherichia coli, 9/30 dòng ức chế Staphylococcus aureus, 22/30 dòng ức chế Pseudomonas aeruginosa, 22/30 dòng ức chế Aeromonas hydrophila và không có dòng vi khuẩn nào có khả năng ức chế Candida albicans. - Từ kết quả khảo sát khả năng đối kháng qua hai phương pháp nhỏ giọt và khuếch tán giếng thạch đã chọn lọc được dòng vi khuẩn có tiềm năng là HF4.2. - Đánh giá tiềm năng kháng khuẩn của vi khuẩn acid lactic phân lập từ sữa mẹ và phân trẻ em. - Trong các nhóm vi sinh vật ở con người thì vi khuẩn acid lactic là nhóm vi khuẩn rất đa dạng và có thể đem lại một số lợi ích cho sức khỏe. - Chúng có khả năng sản sinh nhiều hoạt chất kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin tạo môi trường bất lợi, từ đó ức chế vi sinh vật gây bệnh.. - Trong những năm gần đây, vấn đề kháng lại kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh tăng lên quá mạnh được coi là mối khủng hoảng trên toàn cầu và cần được nền công nghiệp dược phẩm, các viện và tổ chức chính phủ quan tâm chú ý (Varish et al., 2016). - Các vi khuẩn ngày càng dần trở nên kháng kháng sinh do nhiều nguyên nhân như: tỷ lệ vi khuẩn kháng các kháng sinh thông thường khá cao từ đó chúng tiếp tục lan truyền sang các chủng vi khuẩn khác. - Bên cạnh đó vi khuẩn acid lactic rất phổ biến và có tiềm năng vô cùng to lớn trong việc bảo vệ sức khỏe cho con người. - Xuất phát từ nhu cầu tìm ra được các tác nhân kiểm soát sinh học có lợi có nguồn gốc từ con người, nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn acid lactic từ sữa mẹ và phân trẻ em có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh thường gặp ở người.. - Các vi sinh vật chỉ thị bao gồm: Escherichia coli (E. - 2.2 Phân lập vi khuẩn acid lactic từ mẫu sữa mẹ và phân trẻ em. - Môi trường Man, Rosaga và Sharpe bổ sung 0,5 g/L L-Cysteine (MRS-Cys) được dùng để phân lập vi khuẩn từ mẫu. - (2014) sự bổ sung L- Cystein không ảnh hưởng đến sự phát triển của các nhóm vi khuẩn acid lactic khác. - Sau khi hoạt hóa, dung dịch mẫu chứa vi khuẩn được pha loãng thành dãy nồng độ từ 10 -1 đến 10 -6 và trải lên môi trường MRS-Cys agar để tạo các khuẩn lạc rời rạc. - Sau đó tiến hành quan sát, chọn lọc và phân lập các dòng vi khuẩn trên môi trường MRS-Cys agar cho đến khi thuần chủng.. - 2.3 Nhận diện nhóm vi khuẩn acid lactic Sau khi được phân lập thuần chủng, các dòng vi khuẩn được ghi nhận đặc điểm khuẩn lạc sau 72 giờ ủ ở điều kiện kỵ khí ở 37ºC. - Hình dạng tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học, khả năng di động được kiểm tra bằng cách cấy sâu trong ống thạch MRS-Cys bán rắn (0,3% agar). - Vi khuẩn lactic được xác định khi có những đặc điểm như: Gram dương, không sinh bào. - 2.4 Khảo sát khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh. - Các dòng vi khuẩn phân lập được nuôi trong 5 mL môi trường MRS-Cys lỏng ở 37ºC trong 24 giờ.. - Nhỏ 3 µL dịch vi khuẩn lên đĩa chứa sẵn 10 mL môi trường MRS-Cys agar, để khô rồi đem ủ ở 37ºC trong điều kiện kỵ khí trong 24 giờ. - Sau đó các đĩa được phủ lên bằng một lớp 5 mL môi trường Mueller Hinton Agar (MHA) bán rắn (0,7% agar) đã được chủng với 1% dịch nuôi các vi khuẩn E. - Những đĩa này được ủ trong 48 giờ ở 37ºC (riêng vi khuẩn A. - Quan sát vòng ức chế xuất hiện quanh khuẩn lạc. - Vi khuẩn được xem là có khả năng ức chế nếu đường kính vòng ức chế rộng hơn 2 mm (Ngô Thị Phương Dung và ctv., 2011).. - 2.4.2 Phương pháp khuếch tán giếng thạch Các chủng vi khuẩn có khả năng kháng các vi sinh vật gây bệnh được nuôi trong 20 mL MRS-Cys lỏng dưới điều kiện kỵ khí ở 37ºC trong 48 giờ. - ly tâm dịch vi khuẩn ở 13.000 rpm trong 5 phút ở 4ºC;. - Dùng tăm bông vô trùng trải đều dịch huyền phù vi khuẩn hoặc nấm có độ đục bằng với 0,5 McFarland lên đĩa môi trường MHA đối với các vi khuẩn E. - Sau 30 phút chuyển các đĩa sang ủ ở 37ºC (trừ vi khuẩn A. - Khi xuất hiện vòng ức chế quanh các giếng thạch chứng tỏ phần dịch thu được có chứa bacteriocin.. - 2.5 Nhận diện vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rRNA. - Dòng vi khuẩn acid lactic có khả năng đối kháng mạnh với các vi sinh vật chỉ thị được chọn để ly trích DNA và khuếch đại vùng gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R (Lane et al., 1991). - Kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA của vi khuẩn được so sánh với các trình tự trong ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng công cụ BLAST. - Tỷ lệ tương đồng với các trình tự trên cơ sở dữ liệu là cơ sở để định danh vi khuẩn đối kháng.. - 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn acid lactic từ mẫu sữa mẹ và phân trẻ em. - Bốn mươi tám dòng vi khuẩn được phân lập từ 6 mẫu sữa mẹ và 8 mẫu phân trẻ em. - Trong đó, có 22/48 dòng được phân lập từ 6 mẫu sữa mẹ và 26/48 dòng được phân lập từ 8 mẫu phân trẻ em. - Phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc hình tròn hoặc không đều, màu trắng đục hoặc trắng ngà, độ nổi mô hoặc lài, bìa nguyên hoặc răng cưa. - Qua các thử nghiệm sinh hóa chọn lọc được 30/48 dòng có đặc điểm giống với nhóm vi khuẩn acid lactic là có khả năng phân giải CaCO 3 , catalase âm tính, oxidase âm tính, Gram dương, không sinh bào tử và không có khả năng di động. - Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần. - Nguồn gốc phân lập, ký hiệu và đặc điểm tế bào của 30 dòng vi khuẩn acid lactic được trình bày trong Bảng 1.. - Bảng 1: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập từ sữa mẹ và phân trẻ em Nguồn gốc mẫu Dòng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc. - Sữa mẹ HM1.2 Trắng trong, tròn, nguyên, lài Cầu kết đôi. - HM1.3 Trắng ngà, tròn, nguyên, lài Cầu kết đôi HM2.1 Trắng trong, tròn, nguyên, lài Cầu kết đôi. - HM4.1 Trắng trong, tròn, nguyên, lài Que kết thành chữ Y HM4.3 Trắng đục, tròn, nguyên, lài Cầu kết đôi. - HM5.1 Trắng đục, tròn, nguyên, lài Que kết thành chữ Y, V HM5.3 Trắng đục, tròn, nguyên, lài Cầu kết đôi. - HF2.1 Trắng đục, tròn, nguyên, lài Que kết chuỗi HF2.2 Trắng ngà, tròn, nguyên, mô Que kết thành chữ Y HF2.4 Trắng trong, tròn, răng cưa, lài Que kết chuỗi. - HF4.2 Trắng trong, không đều, nguyên, lài Cầu kết đôi HF5.1 Trắng ngà, tròn, nguyên, lài Cầu kết chuỗi HF5.3 Trắng ngà, tròn, răng cưa, lài Que kết thành chữ Y HF6.1 Trắng trong, tròn, nguyên, lài Que kết thành chữ Y HF6.3 Trắng đục, tròn, nguyên, mô Que kết thành chữ Y HF7.1 Trắng trong, tròn, nguyên, lài Que kết thành chữ Y HF7.2 Vàng nhạt, tròn, răng cưa, phẳng Que kết chuỗi HF8.2 Trắng đục, tròn, nguyên, mô Que kết chuỗi HF8.3 Trắng đục, không đều, răng cưa, lài Cầu kết đôi HF8.4 Trắng ngà, tròn, nguyên, lài Cầu kết chuỗi 3.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng. - một số vi sinh vật gây bệnh. - Vi khuẩn lactic trong quá trình phát triển tạo ra một số sản phẩm trao đổi chất như acid lactic hay bacteriocin có khả năng kháng khuẩn. - Khả năng đối kháng các vi sinh vật chỉ thị được kiểm tra lần lượt bằng hai phương pháp nhỏ giọt và khuếch tán giếng thạch.. - Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic thể hiện qua đường kính vòng ức chế, kết quả thu được như ở Bảng 2. - Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng ức chế (ΔD).. - phân lập đều có khả năng kháng lại E. - Duy chỉ có 1 dòng vi khuẩn HF4.2 có khả năng kháng lại C.. - Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic thể hiện tính kháng mạnh với các vi sinh vật chỉ thị, đường kính vòng ức chế khác nhau ở các vi sinh vật chỉ thị như E. - Tuy nhiên chủng HF2.1 thể hiện khả năng đối kháng mạnh nhất với các vi sinh vật chỉ thị so với các dòng vi khuẩn khác. - Đường kính vòng ức chế phụ thuộc vào mức độ nhạy cảm của các vi sinh vật chỉ thị với các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn acid lactic tiết ra môi trường như acid lactic hay bacteriocin.. - aureus với đường kính vòng ức chế 1 – 4 mm. - Khi so sánh với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy tùy thuộc vào dòng vi khuẩn và nguồn gốc phân lập. - mà hoạt tính đối kháng của các dòng vi khuẩn sẽ khác nhau.. - Bảng 2: Kết quả khảo sát khả năng đối kháng các vi sinh vật chỉ thị bằng phương pháp nhỏ giọt Vi sinh vật chỉ thị Số dòng vi khuẩn. - đối kháng Đường kính vòng ức chế (mm). - Hình 1: Khả năng ức chế các vi sinh vật chỉ thị của một số dòng vi khuẩn acid lactic bằng phương pháp nhỏ giọt. - Qua khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của các dòng vi khuẩn, kết quả thu được có 11/30 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế E. - coli, 9/30 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế S. - aureus, 22/30 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế P. - aeruginosa, 22/30 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế A. - hợp bacteriocin ức chế C. - hydrophila khá nhạy cảm với bacteriocin từ các dòng vi khuẩn acid lactic trong khi chỉ có một số dòng có khả năng ức chế E. - Điều này được thể hiện qua đường kính vòng ức chế rất khác nhau giữa các vi sinh vật chỉ thị, P. - aeruginosa cho đường kính vòng ức chế đạt mm, E. - aureus đường kính vòng ức chế chỉ đạt mm. - Kết quả phù hợp với đặc điểm của bacteriocin là có phổ kháng hẹp, chỉ có khả năng ức chế các vi sinh vật có quan hệ gần gũi với loài sản sinh ra chúng. - Đường kính vòng ức chế thay đổi theo từng dòng vi khuẩn lactic và vi sinh vật chỉ thị. - Dòng HF2.1 và HF4.2 là 2 dòng thể hiện khả năng ức chế các vi khuẩn chỉ thị rất mạnh. - (2016) khi khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn acid lactic phân lập từ sữa mẹ cho kết quả có 3 dòng vi khuẩn. - fermentum có khả năng kháng E. - mesenteroides có khả năng kháng S. - (2017) khi khảo sát khả năng đối kháng P.. - Kết quả cho thấy tùy thuộc vào dòng vi khuẩn và nguồn phân lập mà khả năng đối kháng của chúng sẽ khác nhau.. - Bảng 3: Khả năng đối kháng các vi sinh vật chỉ thị của bacteriocin thô từ các dòng vi khuẩn phân lập Vi sinh vật chỉ thị Số dòng vi khuẩn sinh. - bacteriocin đối kháng Đường kính vòng ức chế (mm). - Kết quả so sánh trình tự vùng gen 16S rRNA của dòng HF4.2 với trình tự gen của các loài vi khuẩn khác trong cơ sở dữ liệu GenBank của National Center for Biotechnology Information (NCBI) bằng. - công cụ BLAST cho thấy, trình tự vùng gen 16S rRNA của dòng HF4.2 có độ tương đồng cao nhất là 99% với trình tự của vi khuẩn: Enterococcus faecalis. - Kết hợp với các đặc điểm tế bào hình cầu, dạng liên kết đôi và các thử nghiệm sinh hóa xác định nhóm vi khuẩn acid lactic có thể khẳng định rằng dòng vi khuẩn HF4.2 là Enterococcus faecalis.. - faecalis) được báo cáo là có khả năng gây bệnh nhưng chúng cũng có một vài lợi ích. - Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 48 dòng vi khuẩn trên môi trường MRS-Cys agar, trong đó 22 dòng được phân lập từ sữa mẹ và 26 dòng được phân lập từ phân trẻ em. - Qua khảo sát các đặc điểm hình thái và sinh hóa tuyển chọn được 30 dòng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic.. - Chỉ có duy nhất 1 dòng vi khuẩn HF4.2 có khả năng kháng lại C. - Kết quả kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của các dòng vi khuẩn cho thấy có 11/30 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế E. - hydrophila và không có dòng vi khuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin ức chế C. - Dựa trên kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA, đặc điểm hình dạng tế bào và các thử nghiệm sinh hóa đã xác định được dòng vi khuẩn HF4.2 là Enterococcus faecalis.. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. - Đánh giá tiềm năng probiotic và nhận diện vi khuẩn acid lactic phân lập từ sữa người và chế phẩm men tiêu hóa