- ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TỰ NHIÊN CỦA TÔM CÀNG XANH (MACROBRACHIUM ROSENBERGII) CẢM NHIỄM VI-RÚT. - Haemolymph samples were collected at day after injection for analyzing total haemocyte count, haemocyte identification, phenoloxidase, respiratory burst and superoxide dismutase activities. - Phenoloxidase and respiratory burst activities were found to be significantly higher in infected prawns compared to non-infected ones, but superoxide dismutase activity was lower than those of the first sampling time and control treatment.. - Keywords: Macrobrachium rosenbergii, WSSV, natural immune, total hemocyte, granular cell, hyaline cell, phenoloxidase, respiratory burst, superoxide dismutase Title: Study the natural immune response of freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) with white spot syndrome virus. - Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm càng xanh cảm nhiễm với vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV) trong điều kiện phòng thí nghiệm được thực hiện. - Tôm thí nghiệm được tiêm WSSV tương ứng với 3 nồng LD50, LD50.10-2, LD50.10-4 và một nghiệm thức đối chứng tiêm PBS. - Tôm khỏe được tiêm WSSV vào đốt bụng thứ hai và mẫu máu được thu vào các ngày để phân tích tổng tế bào máu, định loại bạch cầu, hoạt tính của phenoloxidase, superoxide dismutase và khả năng tạo ra hợp chất kháng khuẩn superoxide anion. - Kết quả cho thấy tổng tế bào máu ở tất cả các nghiệm thức cũng như các lần thu mẫu không có sự khác biệt. - Bạch cầu có hạt giảm dần đến ngày thứ 5 sau khi tiêm, sau đó tăng trở lại và bạch cầu không hạt thì tăng, sau ngày thứ 5 thì giảm. - Hoạt tính của phenoloxidase và khả năng tạo superoxide anion cao hơn có ý nghĩa, nhưng hoạt tính của superoxide dismutase thấp hơn so với trước khi tiêm và so với đối chứng.. - Từ khóa: Tôm càng xanh, WSSV, tổng bạch cầu, bạch cầu có hạt, bạch cầu không hạt, phenoloxidase, respiratory burst, superoxide dismutase. - Tuy nhiên, dịch bệnh nhất là bệnh do vi-rút đang là mối nguy hiểm, gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm. - Những bệnh do vi-rút như: vi-rút gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV), vi-rút. - Khả năng gây bện của vi-rút trên tôm có sự khác biệt theo loài tôm. - Tuy nhiên, WSSV lại không gây chết tôm càng xanh (Hameed et al., 2000. - Sarathi et al., 2008). - Cho đến nay cơ chế bảo vệ của tôm càng xanh kháng lại với WSSV vẫn chưa được xác định.. - Việc đề kháng với các mầm bệnh ở tôm chủ yếu nhờ vào các đáp ứng miễn dịch tự nhiên như: hoạt tính của phenoloxidase, khả năng tạo ra hợp chất kháng khuẩn superoxide anion. - (hay hoạt tính respiratory burst) và superoxide dismutase (Ourth và Renis, 1993. - Munoz et al., 2000. - Những biện pháp có thể hạn chế ảnh hưởng của dịch bệnh do vi-rút trên tôm nuôi hiện nay là tăng cường đề kháng cho tôm dựa trên những cơ chế đáp ứng miễn dịch của chúng. - Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một số kết quả nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch tự nhiên của tôm càng xanh được gây cảm nhiễm với dịch chiết WSSV được chuẩn bị từ mẫu tôm sú nuôi. - Trước khi được sử dụng để thực hiện nghiên cứu, 3 mẫu tôm được thu ngẫu nhiên để kiểm tra xác định tôm không bị nhiễm các mầm bệnh ký sinh trùng, vi khuẩn và vi-rút.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị vi-rút gây cảm nhiễm. - Nguồn vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV) sử dụng để gây cảm nhiễm được chuẩn bị theo phương pháp của Oseko et al. - 2.2.2 Phương pháp xác định tổng số bạch cầu và định loại bạch cầu. - Tổng số bạch cầu được đếm theo phương pháp của Le Moullac et al. - Tiêu bản, nhuộm và định loại bạch cầu được thực hiện theo phương pháp của Cornick và Stewart (1978) có điều chỉnh bằng cách dùng ống tiêm (có chứa 200 µl formalin-AS pH 4.6) rút 200 µl máu tôm cho vào ống eppendorf 1.5ml, trộn đều và ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. - Cuối cùng hòa tan phần tế bào máu bằng 50 µl dung dịch formalin-AS. - 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính của Phenoloxidase (PO). - Hoạt tính của Phenoloxidase được xác định theo phương pháp của Herández- López et al. - 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính Respiratory burst. - Hoạt tính Respiratory burst (RES) được thực hiện theo Song và Hsieh (1994). - Để 30 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ zymosan, tế bào máu được rửa 3 lần với 100 µl Hanks’. - Tế bào máu sau đó được rửa 3 lần với 100 µl methanol 70% và để khô. - 2.2.5 Hoạt tính của superoxide dismutase. - Hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) được xác định dựa theo phương pháp của Beauchamp và Fridovich (1971) có điều chỉnh bằng cách cho 50 µl máu (rút bằng ống tiêm có chứa 50 µl dung dịch AS. - 2.2.6 Bố trí thí nghiệm xác định các chỉ tiêu miễn dịch tự nhiên của tôm. - Mỗi con tôm được tiêm 50µl dịch chiết vi-rút đã pha loãng vào cơ ở đốt bụng thứ hai của tôm, bể đối chứng được tiêm dung dịch đệm 1X PBS. - Tôm càng xanh được bố trí 20 con/ bể, với 3 nghiệm thức 1, 2, 3 tương ứng với 3 liều lượng là LD 50 , LD LD 50 .10 -4 và 1 nghiệm thức đối chứng tiêm PBS 1X. - Mỗi nghiệm thức được bố trí lặp lại 3 lần. - Sau đó thu ngẫu nhiên 2 con/bể để lấy máu phân tích các chỉ tiêu miễn dịch. - Sau khi gây cảm nhiễm ngày thu mổi bể 2 con tôm để lấy máu xác định các chỉ tiêu miễn dịch.. - 3.1 Tổng tế bào máu và từng loại bạch cầu. - Ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm, tổng số lượng bạch cầu ở tôm càng xanh sau. - sánh giữa các nghiệm trong cùng thời điểm thu mẫu cũng không có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (Bảng 1). - Tuy nhiên, thành phần từng loại bạch cầu của các nghiệm thức 2 và 3 khác biệt có ý nghĩa (P <. - Bạch cầu có hạt có xu hướng giảm dần đến ngày thứ 5 sau khi tiêm WSSV và sau đó tăng trở lại (Bảng 2) trong khi đó bạch cầu không hạt thì tăng, sau ngày 5 thì giảm (Bảng 3), đặc biệt là ở nghiệm thức 2 bạch cầu không hạt tăng rất đáng kể, từ 16% (trước khi tiêm) đến 80.5% (vào ngày thứ 5) (Hình 1).. - Hình 1: Tế bào bạch cầu tôm càng xanh nhuộm bằng Giemsa (G: bạch cầu có hạt, H: bạch cầu không hạt). - A: Trước khi tiêm. - B: 5 ngày sau khi tiêm. - Bảng 2: Sự thay đổi tỷ lệ bạch cầu có hạt ở Tôm càng xanh khi tiêm WSSV. - Bảng 3: Sự thay đổi tỷ lệ bạch cầu không hạt ở tôm càng xanh khi tiêm WSSV. - A, B, C, D, E: so sánh sự khác biệt trong cùng nghiệm thức. - a, b, c, d, e: so sánh sự khác biệt trong cùng thời gian. - 3.2 Hoạt tính của Phenoloxidase. - Nồng độ phenoloxidase ở các thời điểm thu mẫu khác nhau của cùng nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa (P <. - 0.05) so với lần thu mẫu trước khi tiêm WSSV (trừ. - Ngày thu mẫu 0 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày Đối chứng 40.8 Aa ±1.1 37.9 Aa Aa Aa Aa Aa ± 0.7 Nghiệm thức 1 40.0 Aa Aa Aa Aa Aa Aa ± 6.5 Nghiệm thức 2 38.8 Aa ±1.8 37.4 Aa Aa Aa Aa Aa ± 4.8 Nghiệm thức 3 42.0 Aa ±1.4 39.1 Aa Aa Aa Aa Aa ± 1.4. - Ngày thu mẫu 0 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày Đối chứng 84.0 Aa ±4.2 82.5 Aa ±2.1 82.0 Aa ±1.4 84.5 Aa ±0.7 84.0 Aa ±2.8 83.5 Aa ±2.1 Nghiệm thức 1 86.5 Aa ±2.1 86.0 Aa ±2.8 85.0 Aa ±4.2 83.0 Aa ±4.2 84.0 Aa ±1.4 93.5 Aa ±3.5 Nghiệm thức 2 84.0 Aa ±2.8 84.0 Aa ±1.4 86.0 Aa ±4.2 19.5 Bb ±2.1 46.0 Cb ±4.2 87.0 Aa ±2.8 Nghiệm thức 3 83.0 Aa ±1.4 86.5 Ba ±2.1 87.5 BCa ±0.7 72.5 Dc ±0.7 69.0 Ec ±0.0 90.0 Ca ±1.4. - Ngày thu mẫu 0 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày Đối chứng 16.0 Aa Aa Aa Aa Aa Aa ± 2.1 Nghiệm thức 1 13.5 Aa Aa Aa Aa Aa ± 1.4 6.5 Aa ± 3.5 Nghiệm thức 2 16.0 Aa Aa Aa Bb Cb Aa ± 2.8 Nghiệm thức 3 17.0 Aa Ba BCa Dc Ec Ca ± 1.4. - nghiệm thức đối chứng không có sự khác biệt) (Hình 2). - Hoạt tính của phenoloxidase tăng dần ở cả 3 nghiệm thức. - Nghiệm thức 1 và 2 bắt đầu tăng ở ngày thứ 3 đến ngày thứ 5. - Riêng nghiệm thức 3 tăng chỉ sau 1 ngày tiêm và tăng đến ngày thức 3 sau đó giảm dần. - Hoạt động của phenoloxidase sau khi giảm thì không có sự khác biệt so với trước khi tiêm WSSV.. - 3.3 Hoạt tính của Respiratory burst. - Nồng độ respiratory burst ở nghiệm thức đối chứng không có sự khác biệt giữa các lần thu mẫu. - Tuy nhiên, ở cả 3 nghiệm thức tiêm WSSV đều cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa ( P <0.05) từ ngày đầu tiên so với trước khi tiêm. - Sau khi tiêm hoạt tính của respiratory burst tăng cao sau đó giảm dần và đến ngày thứ 10 thì trở nên thấp hơn có ý nghĩa so với trước khi tiêm WSSV. - Tương tự, ở các lần thu mẫu khác nhau hoạt tính của respiratory burst ở 3 nghiệm thức tiêm WSSV khác biệt có ý nghĩa (P <. - 0.05) so với nghiệm thức đối chứng. - Cụ thể là trước khi tiêm thì không có sự khác biệt, nhưng ở ngày 1 thì cả 3 nghiệm thức đều cao hơn đối chứng, các ngày 5, 10, 15 lại thấp hơn đối chứng (Hình 3).. - 3.4 Hoạt tính của Superoxide dismutase. - Nếu như phenoloxidase và respiratory burst hoạt động mạnh ngay sau khi tiêm WSSV thì hoạt động của thì superoxide dismutase lại không có sự khác biệt so với lần thu mẫu trước khi tiêm. - Hoạt động của superoxide dismutase chỉ thay đổi có ý nghĩa (P <. - Khi so sánh giữa các nghiệm thức cũng cho thấy khi tiêm WSSV thì hoạt động của superoxide dismutase cũng chỉ thay đổi giảm có ý nghĩa so với đối chứng tiêm PBS sau 10 ngày tiêm.. - Hình 3: Sự thay đổi hoạt tính của respiratory burst của Tôm càng xanh cảm nhiễm WSSV. - Hình 4: Sự thay đổi hoạt tính theo thời gian của superoxide dismutase của Tôm càng xanh cảm nhiễm WSSV. - (2000) và Sarathi et al. - (2008) thì WSSV cũng nhiễm trên tôm càng xanh những nó không gây chết tôm mà nhiễm một thời gian, sau đó không còn phát hiện WSSV trên tôm càng xanh nữa. - Trên cơ sở đó nghiên cứu này được thực hiện để tìm hiểu sự thay đổi các chỉ tiêu liên quan đến đáp ứng miễn dịch của tôm càng xanh khi cảm nhiễm với WSSV với những liều cảm nhiễm vi-rút khác nhau.. - Theo Sarathi et al. - (2008) thì tổng tế bào máu tôm càng xanh sau khi tiêm WSSV 1 và 3 ngày khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng không tiêm WSSV và các ngày sau đó. - Tuy nhiên, theo tác giả này thì tổng tế bào máu giảm đột ngột chỉ sau 1 ngày tiêm, sau đó tăng trở lại bình thường. - Sự khác biệt này so với kết quả trong nghiên cứu này có thể là do ảnh hưởng của liều lượng dịch chiết tiêm vào tôm thí nghiệm. - Theo Söderhäll và Cerenius (1992) thì chức năng của bạch cầu có hạt là hoạt hóa hệ thống phenoloxidase. - Từ đó cho thấy bạch cầu có hạt tăng dần đến ngày 3 và hoạt tính của phenoloxidase cũng tăng dần là hoàn toàn phù hợp. - Kết quả phân tích hoạt tính của phenoloxidase cũng giống với báo cáo của Sarathi et al. - (2008) với nồng độ phenoloxidase tăng dần đến ngày thứ 5 và sau đó giảm, sự khác biệt có ý nghĩa (P <. - 0.05) ở ngày 3 và 5 so với đối chứng. - (2000) thì ngoài vai trò trong melanin hóa của PO, các thành phần của hệ thống hoạt hóa proPO còn kích thích các phản ứng bảo vệ tế bào bao gồm cả thực bào, hình thành hạch, phong tỏa và vận động bạch cầu. - Kết quả trên cho thấy rằng ban đầu PO gia tăng sau 1 ngày tiêm là do bạch cầu giải phóng prophenoloxidase để đáp ứng lại với WSSV nhằm bảo vệ tế bào. - Sau 5 ngày khi tôm trở lại bình thường thì PO giảm và trở lại bình thường là do bạch cầu ngưng giải phóng ProPO.. - Sự thay đổi nồng độ respiratory burst và superoxide dismutase trong nghiên cứu của chúng tôi có khác so với Sarathi et al. - Theo tác giả này thì nồng độ respiratory burst tăng đến ngày thứ 10, sau đó bắt đầu giảm còn nồng độ superoxide dismutase giảm các ngày thứ 1, 3, 5 và sau đó tăng.. - Ở tôm càng xanh cảm nhiễm WSSV không có sự khác biệt về tổng tế bào máu so với tôm không cảm nhiễm và giữa các nhóm tôm cảm nhiễm WSSV với mức độ khác nhau. - Tuy nhiên, tỷ lệ các loại bạch, hoạt tính của phenoloxidase, respiratory burst, superoxide dismutase cũng có những sự thay đổi nhất định có ý nghĩa. - Như vậy, tôm càng xanh có biểu hiện đáp ứng miễn dịch tự nhiên khi nhiễm WSSV.. - Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels