- GIA TĂNG TỐC ĐỘ PHÂN HỦY SINH HỌC HOẠT CHẤT PROPOXUR TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LỎNG BẰNG VI KHUẨN Paracoccus SP. - Biochar, sự cố định, vi khuẩn Paracoccus sp. - Biochar, immobilization, Paracoccus sp. - Paracoccus sp. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá hiệu quả của một số phương pháp chủng vi khuẩn khác nhau lên khả năng phân hủy sinh học hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur trong môi trường lỏng. - Vi khuẩn phân hủy chuyên biệt Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 được phân lập từ mẫu đất nhiễm Propoxur, được chủng vào môi trường nuôi cấy. - Vi khuẩn được chủng vào môi trường qua hai dạng: 1) dạng vi khuẩn tự do trong dung dịch và 2) dạng vi khuẩn cố định trong biochar. - Mật số vi khuẩn và nồng độ Propoxur được theo dõi theo thời gian thí nghiệm. - Tổng mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 ở tất cả các nghiệm thức có chủng vi khuẩn tăng từ 1,1-2,0 lần trong thời gian thí nghiệm so với mật số ban đầu. - Điều này chứng tỏ vi khuẩn Paracoccus sp.. - P23-7 có khả năng tồn tại và phát triển tốt trong môi trường lỏng mới. - Tuy nhiên, mật số vi khuẩn ở hai nghiệm thức bổ sung biochar cao hơn rất nhiều so với nghiệm thức chủng Paracoccus sp. - Môi trường lỏng chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - Vì vậy, kết quả nghiên cứu này cho phép kết luận rằng, việc ứng dụng một thể phức hợp gồm biochar và dòng vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất nông dược là phương pháp triển vọng nhất trong việc gia tăng tốc độ phân hủy sinh học đối với độc chất hữu cơ trong môi trường lỏng.. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu đánh giá hiệu quả của biochar như là chất mang dùng để cố định vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 giúp gia tăng phân hủy sinh học hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng để làm cơ sở và nền tảng cho việc ứng dụng và xử lý đất ô nhiễm với Propoxur.. - Biochar rác đô thị được dùng trong nghiên cứu này vì theo kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 trong biochar rác đô thị cao hơn trong các biochar thử nghiệm khác trong môi trường nuôi cấy lỏng (Nguyễn Khởi Nghĩa và ctv., 2015). - Mục đích của việc rửa biochar trước khi bố trí thí nghiệm là nhằm loại bỏ màu đen của biochar khi cho vào trong nước và giúp cho việc quan sát sự phát triển vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng ở nghiệm thức bổ sung biochar dễ dàng hơn. - 2.2 Nguồn vi khuẩn. - Dòng vi khuẩn phân hủy chuyên biệt và rất hiệu quả thuốc trừ sâu Propoxur, với tên định danh là Paracoccus sp. - Trước tiên vi khuẩn được nuôi trong bình tam giác 100 mL chứa 25 mL dung dịch giàu dinh dưỡng (glucose yeast extract) trong 3 ngày trên máy lắc với tốc độ 100 rpm. - Thành phần của môi trường GYM trong 1 L dung dịch bao gồm: 10 g glucose và 10 g yeast extract. - Sau đó, sinh khối vi khuẩn được thu hoạch bằng cách ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trên máy ly tâm. - Lặp lại 4 lần việc rửa sinh khối vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng nhằm loại bỏ hoàn toàn dinh dưỡng và nguồn carbon còn sót lại trong môi trường nuôi cấy. - Hiệu chỉnh độ đục của dung dịch chứa vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng bằng máy đo quang phổ về OD 600 nm x10 6 CFUs/mL). - Nguồn vi khuẩn đã sẵn sàng cho bố trí thí nghiệm. - Xác định mật số vi khuẩn ban đầu sau khi hiệu chỉnh độ đục bằng phương pháp nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982): tiến hành pha loãng dung dịch vi khuẩn theo hệ số 10 với các nồng độ pha loãng khác nhau. - Hút 50 µL dung dịch vi khuẩn của mỗi nồng độ pha loãng và nhỏ 5 giọt lên trên bề mặt môi trường TSB. - Các đĩa môi trường TSB chứa vi khuẩn được đặt vào túi nylon và ủ trong tủ ủ ở nhiệt độ 35 o C trong ba ngày, sau đó, đếm mật số khuẩn lạc.. - Ehrenstorfer GmbH, Đức), 1 mL dung dịch vi khuẩn Paracoccus sp. - Đối chứng, không chủng vi khuẩn. - Đối chứng, không chủng vi khuẩn + 1,5 g biochar. - Chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - Chủng 1,5 g biochar chứa sẵn vi khuẩn Paracoccus sp. - Ghi chú: Quy trình chuẩn bị biochar chứa vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 cho nghiệm thức 5 như sau: 1,5 g biochar được cho bình tam giác tiệt trùng 100 mL chứa 24 mL dung dịch khoáng tối thiểu bổ sung 40 ppm Propoxur và 1 mL dung dịch vi khuẩn (đã được chuẩn bị ở mục 2.2) và được nuôi cấy 4 ngày trước khi bố trí thí nghiệm trên máy lắc với tốc độ 90 rpm trong tối. - Vào thời điểm bố trí thí nghiệm, toàn bộ 1,5 g biochar đã chứa vi khuẩn được chuyển qua bình tam giác mới. - Tuy nhiên, trước khi cho vào bình tam giác mới, biochar được rửa sạch nhằm loại bỏ vi khuẩn Papacoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy (trong 25 mL môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trong 25 mL môi trường nuôi cấy lỏng + trong 1,5 g biochar) và nồng độ hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur còn lại trong môi trường nuôi cấy lỏng vào các thời điểm và 11 ngày sau khi nuôi cấy.. - Tham khảo mục 2.2 cho quy trình đếm mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy lỏng.. - Quy trình đếm mật số vi khuẩn Paracoccus sp.. - P23-7 cố định trong biochar được thực hiện như sau: Tại thời điểm thu mẫu, lấy 0,1 g biochar (trọng lượng khô) trong bình tam giác nuôi cấy chia làm hai phần dưới điều kiện tiệt trùng: 0,05 g biochar dùng cho việc xác định ẩm độ biochar cho phần tính toán số liệu, phần còn lại với trọng lượng 0,05 g dùng cho việc đếm mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - Phần biochar này được rửa sạch với nước khử khoáng tiệt trùng (xem mục 2.3 cho quy trình rửa biochar để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn Paracoccus sp. - Sau đó, đếm mật số vi khuẩn hiện diện trên đĩa. - Quy trình đo nồng độ Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, viết tắt là HPLC) như sau: Vào thời điểm thu mẫu, hút 1mL môi trường nuôi cấy lỏng cho vào Eppendorf 2 mL, sau đó, ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. - 3.1 Sự phát triển tổng mật số vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy. - Kết quả về sự phát triển tổng mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy lỏng của các nghiệm thức theo thời gian nuôi cấy được trình bày trong Hình 1. - Tổng mật số vi khuẩn. - Ở hai nghiệm thức này, tổng mật số vi khuẩn ở các thời điểm thu mẫu cao hơn gấp 1,5–2,0 lần so với tổng mật số vi khuẩn vào thời điểm bắt đầu bố trí thí nghiệm. - Trong khi đó, ở nghiệm thức không bổ sung bichar, tổng mật số vi khuẩn trong 25 mL dung dịch nuôi cấy tăng chậm và đạt đỉnh cao nhất vào ngày thứ 3 sau khi bố trí thí nghiệm, sau đó, tổng mật số vi khuẩn giảm xuống theo thời gian nuôi cấy. - Ở nghiệm thức này, tổng mật số vi khuẩn ở các thời điểm thu mẫu cao hơn gấp 1,1 - 1,4 lần so với tổng mật số vi khuẩn vào thời điểm bắt đầu bố trí thí nghiệm. - Khi so sánh tổng mật số vi khuẩn giữa các nghiệm thức với nhau vào các thời điểm thu mẫu cho thấy, tổng mật số vi khuẩn ở hai nghiệm thức: Biochar chứa vi khuẩn Paracoccus sp. - Kết quả này cho thấy biochar đã giúp gia tăng sự phát triển mật số vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy lỏng. - Điều này có thể giải thích là do biochar đã có khả năng làm gia tăng pH môi trường nuôi cấy (Aciego và Brookes, 2008), sự gia tăng pH môi trường đã giúp gia tăng mật số vi khuẩn, hoặc cũng có thể chính biochar đã cung cấp một lượng dinh dưỡng thiết yếu, đặc biệt là một số nguyên tố vi lượng như: Mo và Bo, giúp cho vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 sinh trưởng và phát triển tốt hơn, hoặc có thể biochar đã có khả năng hấp thu hay cô đặc dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy, điều này giúp cho vi khuẩn cố định trong biochar dễ dàng tiếp cận với nguồn dinh dưỡng này (Treseder và Allen, 2002).. - Khi so sánh hai nghiệm thức bổ sung biochar với nhau cho thấy cả hai không khác biệt thống kê về tổng mật số vi khuẩn (trong 25 mL môi trường nuôi cấy và trong 1,5 g biochar) vào các thời điểm thu mẫu, ngoại trừ vào thời điểm 11 ngày sau khi bố trí thí nghiệm.. - Tóm lại, biochar rác đô thị có khả năng cố định tốt vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy lỏng và biochar rác đô thị giúp gia tăng tổng mật số Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy.. - Hình 1: Sự phát triển tổng mật số vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy lỏng giữa các nghiệm thức. - 3.2 Nồng độ hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng giữa các nghiệm thức theo thời gian nuôi cấy. - Khả năng phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng của các nghiệm thức được trình bày trong Hình 2. - Nồng độ hoạt chất Propoxur trong hai nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn được giải thích là do Propoxur có thể bị thủy phân (1,5%/ngày) trong môi trường nước có pH =7 (Hartley và Kidd, 1983). - Bên cạnh đó, nồng độ Propoxur còn lại trong môi trường nuôi cấy lỏng của hai nghiệm thức đối chứng ở tất cả các thời điểm thu mẫu đều cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với 3 nghiệm thức có chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - Điều này cho thấy dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 thật sự là dòng vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur.. - Khi so sánh ba nghiệm thức chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 (nghiệm thức 3, nghiệm thức 4 và nghiệm thức 5) với nhau về khả năng phân hủy Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng cho thấy, ở tất cả các thời điểm thu mẫu nồng độ Propoxur còn lại trong môi trường nuôi cấy lỏng ở 3 nghiệm thức được xếp hạng như sau: nghiệm thức 5: Biochar chứa dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - nghiệm thức 4: Dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - nghiệm thức 3: Dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - Nồng độ Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng bị phân hủy hoàn toàn ở ba nghiệm thức 5, 4 và 3 lần lượt sau: 2, 3 và 5 ngày sau khi nuôi cấy. - Đặc biệt khi so sánh hai nghiệm thức 3 và 4 với nhau cho thấy như sau: mặc dù hai nghiệm thức này có cùng điều kiện thí nghiệm và mật số vi khuẩn ban đầu như nhau, nhưng nghiệm thức có bổ sung biochar dẫn đến tốc độ phân hủy Propoxur trong môi trường nuôi cấy lỏng (nghiệm thức 4) xảy ra nhanh hơn so với nghiệm thức không bổ sung biochar (nghiệm thức 3). - Kết quả này cho thấy vi khuẩn phân hủy chuyên biệt Propoxur, Paracoccus sp. - Nghiệm thức 4: vi khuẩn Paracoccus sp. - Biochar chứa vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 có thể là do ở nghiệm thức 4, vi khuẩn cần phải có một khoảng thời gian nhất định để được cố định trong biochar và sau đó tiến trình phân hủy Propoxur mới bắt đầu xảy ra, trong khi ở nghiệm thức 5, vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 đã được cố định sẵn từ ban đầu, do đó, khi được chủng vào môi trường nuôi cấy thì tiến trình phân hủy hoạt chất Propopur có thể xảy ra ngay lập tức. - Việc bổ sung biochar giúp gia tăng tốc độ phân hủy hoạt chất Propoxur của dòng vi khuẩn Paracoccus sp.. - P23-7 trong môi trường nuôi cấy lỏng so với nghiệm thức không bổ sung biochar có thể được giải thích là do khi vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur bị cố định trong biochar có thể tạo ra một hệ vi sinh vật sống cộng sinh với nhau, điều này giúp chúng tạo ra một lực tổng hợp gồm tất cả các vi khuẩn cố định trong biochar lại với nhau dùng để lấy Propoxur tự do. - trong môi trường lỏng mạnh hơn so với lực riêng lẻ của từng tế bào vi khuẩn, do đó, dòng di chuyển của Propoxur trong môi trường lỏng đến biochar chứa vi khuẩn cố định nhanh hơn so với sự di chuyển của Propoxur đến từng vi khuẩn riêng lẻ sống tự do trong môi trường nuôi cấy lỏng và điều này được chứng minh bởi Grundmann và ctv (2007). - Ngoài ra, vi khuẩn cố định trong biochar có thể đã hình thành biofilm, giúp bảo vệ chúng sống sót tốt hơn trong những điều kiện bất lợi của môi trường như thiếu dinh dưỡng, thay đổi pH hoặc những nhân tố khác (Wang và ctv, 2010b).. - Tóm lại, biochar rác đô thị có chức năng như là chất mang giúp cố định và bảo vệ vi khuẩn phân hủy hoạt chất Propoxur, Paracoccus sp. - Vi khuẩn cố định trong biochar có khả năng gia tăng tốc độ phân hủy đối với Propoxur so với vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 tự do trong môi trường nuôi cấy.. - Hình 2: Nồng độ hoạt chất Propoxur còn lại trong môi trường nuôi cấy lỏng giữa các nghiệm thức theo thời gian nuôi cấy. - Biochar rác đô thị có khả năng cố định vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp.. - P23-7 trong môi trường lỏng, đồng thời, biochar. - còn giúp gia tăng tổng mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - thị chứa vi khuẩn phân hủy chuyên biệt Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 cố định từ ban đầu giúp gia tăng tốc độ phân hủy và giảm thời gian lưu tồn hoạt chất Propoxur trong môi trường lỏng.. - Biochar rác đô thị có chức năng như là chất mang hữu hiệu giúp bảo vệ vi khuẩn sống sót trong điều kiện bất lợi của môi trường và được ứng dụng trong xử lý sinh học đất ô nhiễm với hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur.. - Đánh giá khả năng phân hủy thuốc trừ sâu Propoxur của dòng vi khuẩn phân lập từ nền đất bảo quản hành tím tại thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.