- GÓP PH ẦN NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHẢN ỨNG ESTERAZA. - B ẰNG PHƯƠNG PHÁP TÍNH LƯỢNG TỬ. - GÓP PH ẦN NGHIÊN C ỨU C Ơ CH Ế PH Ả N ỨNG ESTERAZA B ẰNG PH ƯƠ NG PHÁP TÍNH L ƯỢNG T Ử. - Phương pháp nghiên cứu. - Phương pháp phiếm hàm mật độ. - Cơ học phân tử. - Kết hợp phương pháp cơ học lượng tử-cơ học phân tử. - Áp dụng phương pháp QM/MM đối với hệ phản ứng. - C ấu trúc enzyme. - Cơ chất trong hốc phản ứng ở trạng thái chưa liên kết. - Ngày nay cùng v ới sự hoàn thiện của các phương pháp tính toán hóa lượng t ử, sự quan tâm của hóa học lý thuyết đến lĩnh vực xúc tác enzyme ngày càng lớn.. - Nghiên cứu hệ xúc tác enzyme làm sáng tỏ bản chất hóa học của các phản ứng trong cơ thể sống. - Một khi các phương pháp lý thuyết thành công trong lĩnh vực này sẽ m ở đường cho việc tìm kiếm dược phẩm mới điều trị nhiều loại bệnh tật cho con người mà không còn phải mò mẫm nhất là khi việc thử nghiệm thuốc mới trên cơ th ể con người không thể tùy tiện.. - Về mặt động học xúc tác, đây là loại enzyme có hoạt tính xúc tác đặc biệt cao, nó tham gia tr ực tiếp vào phản ứng hóa học và thể hiện đầy đủ các nhân tố mà một xúc tác enzyme có thể tác động đến phản ứng hóa học.. - Hi ện nay các phương pháp lý thuyết nghiên cứu hệ xúc tác enzyme chưa hoàn thi ện, vì vậy việc tiếp cận để cải tiến các phương pháp này là một hướng phát triển được ưu tiên vì nó s ẽ tạo ra một bước nhảy vọt trong hóa lý thuyết, đưa lý thuy ết tiến gần đến thực nghiệm hơn.. - Lu ận văn này dùng một phương pháp đang phổ biến hiện nay khi nghiên cứu hệ xúc tác là phương pháp QM/MM với kĩ thuật ONIOM. - Ở đây, phương pháp này được dùng kế t h ợp với các tính toán đơn giản hơn làm cơ sở dự đoán cơ chế phản ứng nhằm xây dựng một quy trình có hệ thống để nghiên cứu hệ xúc tác enzyme nói chung.. - Cấu trúc. - Để giải thích tính chất chọn lọc của phản ứng xúc tác enzyme, Fischer đề xu ất mô hình chìa khóa - ổ khóa, theo đó, cơ chất và enzyme có hình dạng đặc thù phù hợp với nhau. - Tăng nhiệt độ để tăng tốc phản ứng. - Đa số các phản ứng xúc tác enzyme đều có vai trò hóa h ọc c ủa m ột tâm ho ạt động và phần còn lại của phân tử enzyme đóng vai trò môi trường, tạo thuận lợi về. - m ặt không gian và t ươ ng tác t ĩnh đ i ện . - Khi nghiên c ứu cơ chế phản ứng xúc tác enzyme bằng các phương pháp tính toán cần làm rõ được cả 2 hướng tác động này.. - Phản ứng xảy ra tại một hốc sâu bên trong phân tử acetylcholinesterase.. - 3 Đơn vị aminoaxit Ser(200) với nhóm OH tham gia phản ứng hóa học. - Hầu hết các phần m ềm đánh giá độ thích nghi liên hệ trực tiếp với năng lượng của cấu hình dựa vào các phương pháp trường lực cơ học phân tử. - Ngoài ra còn có thể dùng các phương pháp “học máy” để xây d ựng hà m thích nghi v ới dữ liệu học là dữ liệu thực nghiệm.. - AutoDock Vina: k ết hợp tối ưu cục bộ với phương pháp Monte -Carlo.. - Cơ sở của phương pháp này là dựa vào định đề Hohenberg -Kohn kh ẳng định tồn tại tương ứng một - một giữa mật độ electron và năng lượng của hệ. - Để sử dụng phương pháp phiếm hàm mật độ cần phải thiết lập mối liên hệ giữa năng lượng và mật độ electron E[ρ]. - Hai định đề trên là cơ sở của phương pháp phiếm hàm mật độ nhưng chưa ch ỉ ra được cách áp d ụng vào h ệ c ụ th ể vì ch ư a đư a ra được m ột d ạng phi ếm hàm phù h ợp liên h ệ gi ữa n ă ng l ượng và m ật độ electron. - Ph ần sai s ố cùng v ới t ươ ng tác gi ữa các electron. - d ẫn đến ph ươ ng trình. - Nhi ều dạng phiếm hàm tương quan - trao đổi đã được đưa ra, việc xây dựng các d ạng gần đúng này dựa vào so sánh với thực nghiệm hoặc trên cơ sở so sánh với một phương pháp hàm sóng mức cao. - Phi ếm hàm B3LYP là d ạng phi ếm hàm th ường dùng trong khi nghiên c ứu các hệ hóa học theo phương pháp DFT. - Trong các phương pháp trường lực, năng lượng điện tử với một cấu hình hạt nhân cho trước được tính bằng cách viết lại E e dưới dạng một hàm tham s ố của các tọa độ hạt nhân. - Các tham số đưa vào hàm này được lấy phù hợp với thực nghiệm hay t ừ các phương pháp tính toán mức cao hơn. - C ũng giống như E str , đây là d ạng đơn giản nhất của E bend , để chính xác hơn có t h ể đưa thêm vào các số hạng khai triển bậc cao hơn và hiệu chỉnh cho phù hợp với dữ kiện thực nghiệm hoặc các phương pháp tính toán lượng tử mức cao.. - D ạng hàm này cũng được hiệu chỉnh phù hợp với các phương pháp tính m ức cao để cho kết quả tin cậy hơn.. - Điện tích của nguyên tử cũng được phân bổ cho phù hợp với các phương pháp tính m ức cao hoặc dữ kiện thực nghiệm giống như các tương tác khác trong trường lực.. - Như vậy, đối với các phương pháp trường lực, các phép tính đều được viết ở d ạng cơ học cổ điển, do đó cho kết quả tính toán nhanh chóng, vấn đề cốt yếu của các phương pháp này là xác định các tham số để đưa vào biểu thức tính. - Những bộ tham số này đều phải phù hợp tương đối với thực nghiệm hoặc các phương pháp tính toán lượng t ử mức cao. - K ết h ợp ph ươ ng pháp c ơ h ọc l ượng t ử -c ơ h ọc phân t ử. - Các phương pháp tính toán lượng tử tuy cho k ết qu ả chính xác nh ư ng l ại không thích h ợp với những hệ như vậy do khối lượng tính toán quá lớn và việc thực hiện tính lượng tử cho nh ững h ệ hàng nghìn nguyên t ử là đ i ều hoàn toàn không kh ả thi.. - Phương pháp kết hợp lợi dụng đặc điểm là trong hầu hết các phản ứng với xúc tác enzyme, quá trình phá v ỡ và hình thành liên kết chỉ xảy ra trên tâm hoạt động có sự tham gia của một số ít các nguyên t ử trong phân tử protein, ảnh hưởng c ủa phần còn lại trên protein thường chỉ là về mặt không gian và tương tác tĩnh điện. - Trong phương pháp kết hợp, mỗi vùng được xử lí bằng một phương pháp tính khác nhau. - Ph ần hoạt động hóa học được xử lí bằng phương pháp tính toán lượng tử. - mô t ả chính xác sự phá vỡ, hình thành liên kết hóa học, phần còn lại có thể được xử lí b ằng các phương pháp đỡ tốn kém thời gian hơn. - Trước khi phương pháp kết h ợp được áp dụng rộng rãi, mô hình tâm hoạt động là một giải pháp nghiên cứu hoạt tính xúc tác của enzyme. - Khi đó, chỉ một ph ần phân tử có tâm hoạt động được sử dụng trong mô hình nghiên cứu và việc tính toán bằng các phương pháp lượng tử không m ấy khó khă n. - Vì v ậy, hiện tại phương pháp kết hợp đang là phương pháp hiệu quả nghiên cứu hệ xúc tác enzyme.. - V ề nguyên tắc, có nhiều ki ểu k ết h ợ p các phương pháp t ính v ới nhau nhưng ph ổ biến là kết hợp giữa phương pháp lượng tử và cơ học phân tử - QM/MM.. - Phương pháp kết hợp lượng tử/cơ học phân tử được tiên phong bởi Warshel và Levitt vào năm 1976. - Trong đó, Warshel đưa ra biểu thức nă ng lượng khi dùng k ết hợp phương pháp như sau. - Trong ph ần m ềm Gausian, ph ươ ng pháp k ết h ợp được th ực hi ện v ới k ĩ thu ật ONIOM. - Phân t ử được chia thành các vùng ở m ức cao và m ức th ấp , m ỗi vùng áp dụng một phương pháp tính, trong phương pháp QM/MM thì vùng cao áp dụng một ph ươ ng pháp c ơ h ọc l ượng t ử , vùng th ấp áp d ụng ph ươ ng pháp c ơ h ọc phân t ử . - ở đâ y Real ch ỉ toàn b ộ h ệ th ực , Model ch ỉ vùng QM, High ch ỉ ph ươ ng pháp áp dụng ở mức cao, Low chỉ phương pháp áp dụng cho mức thấp. - Do áp dụng các phương pháp khác nhau cho mỗi vùng nên có sự gián đoạn qua ph ần phân c ắt . - Các ph ươ ng pháp th ường được s ử d ụng để xác định c ấu trúc trên PDB là xác định c ấu trúc tinh th ể dùng tia X, ph ươ ng pháp ph ổ c ộng h ưởng t ừ NMR, và phương pháp hiển vi điện tử nhiệt độ thấp. - Phương pháp QM/MM được th ực hi ện trên ph ần m ềm này. - Ph ần x ả y ra ph ản ứng hóa h ọc c ần n ằm tr ọn trong v ùng được tính toán bằng phương pháp chính xác (mức cao). - Phương pháp dùng ở mức thấp phải nhanh nhưng vẫn đảm bảo mô tả được các hi ệu ứng gây ra b ởi vùng này. - Ph ần còn l ại c ủa phân t ử enzyme ch ủ y ếu gây ra hi ệu ứng v ề m ặt không gian và t ĩnh đ i ện đối với cơ chất nên phương pháp MM với các thành phần trường lực đã nói ở ch ươ ng 1 có th ể đáp ứng được quy t ắc này.. - Nguyên t ử thay th ế không tham gia vào quá trình hóa h ọc và cách xa tâm phản ứng hóa học (tức là phần QM có kích thước lớn) để đảm bảo ph ần sai l ệch ảnh h ưởng không đáng k ể. - Đây chính là hốc phản ứng có đơn vị Ser(200) ở đáy. - Kết quả này phù hợp v ới dữ kiện thực nghiệm về vị trí phản ứng.. - ở các tr ạng thái còn l ại acetylcholine neo đậu tại các vị trí bên ngoài của phân tử acetylcholinesterase nh ư ng t ại các v ị trí này ngoài y ếu t ố t ĩnh đ i ện và liên k ết hydro, không có đ i ều ki ện để phản ứng hóa học xảy ra.. - Áp d ụng phương pháp QM/MM đối với hệ phản ứng 3.2.1. - Phân vùng tính toán: đơ n v ị aminoaxit Ser(200) được tính ở m ức cao theo phương pháp DFT, phiếm hàm B3LYP, phần còn lại trong phân tử acetylcholinesterase được tính ở m ức th ấp , ph ươ ng pháp c ơ h ọc phân t ử , tr ường l ực AMBER. - 8 B ề mặt của acetylcholine và hốc phản ứng trên acetylcholinesterase (hai c ấu trúc đ ã được t ối ưu. - Ta th ấy kích th ước nhóm amin b ậc b ốn khá l ớn so v ới kích th ước c ửa h ốc phản ứng và cơ chất không thể đi qua để vào hốc phản ứng nếu cấu trúc của protein c ứng nh ắc do s ự cản trở của Tyr(121) và Phe(330) (xem hình 3.12). - C ùng v ới nh ận xét đ ã nêu khi ti ến hành docking ta có th ể kh ẳng định là enzyme acetylcholinesterase có cấu trúc thay đổi linh hoạt trong quá trình phản ứng và acetylcholine di chuy ể n vào trong h ốc ph ản ứng không ch ỉ tuân theo định lu ật khuếch tán thông thường mà qua các trạng thái neo đậu bền cục bộ. - Trạng thái của acetylcholine trong hốc phản ứng cũng được tối ưu dựa vào định h ướng trong quá trình docking. - 9 Trạng thái acetylcholine trong hốc phản ứng đã được tối ưu. - S ự bi ến đổi c ấu trúc c ủa c ơ ch ất trong h ốc phản ứng so với trạng thái tự do ( đ ã t ối ư u) th ể hiện trong hình 3.10. - 10 S ự biến đổi cấu trúc acetylcholine trong hốc phản ứng so với tr ạng thái tự do. - T ừ các số liệu trong bảng 2 ta th ấy độ dài c ủa các liên k ết khi acetylcholine vào trong hốc phản ứng nói chung lớn hơn so với trạng thái tự do, sự biến đổi góc liên k ết th ể hi ện không rõ ràng. - Độ dài liên kết, góc liên kết và góc nhị diện của acetylcholine trong hốc phản ứng và trạng thái tự do.. - nguyên t ử NA NB NC Acetylcholine trong h ốc phản ứng Acetylcholine t ự do. - C ấu trúc hốc phản ứng khi có acety lcholine c ũng biến đổi so với khi chưa có acetylcholine (hình 3.12).. - 12 S ự biến đổi cấu trúc hốc phản ứng khi có (nét đậm) và không có cơ chất (nét mảnh). - Các đơn vị aminoaxit trong hốc phản ứng có cấu trúc biến đổi nhi ều nhất, có xu hướng giãn ra, các mạch nhánh được định hướng lại.. - Nếu chỉ xét phần cấu trúc khung của protein trong hốc phản ứng thì độ lệch chỉ nhỏ hơn RMSD = 0.006 Å . - Tuy nhiên c ấu trúc hốc phản ứng biến đổi không nhiều, chỉ có sự thay đổi ở nhánh c ủa Ser(200) là rõ ràng (hình 3.15). - 15 C ấu trúc hốc phản ứng trong trạng thái tạo phức (nét đậm) và chưa tạo phức (nét mảnh). - Cấu trúc hốc phản ứng thay đổi không nhiều so với trạng thái phức, chỉ có sự thay đổi ở mạch nhánh của một số aminoaxit phía cửa hốc (hình 3.17).. - 17 H ốc phản ứng trong trạng thái sản phẩm (nét mảnh) và tr ạng thái phức (nét đậm). - Trong c ả 3 trạng thái với sự có mặt của cơ chất trong hốc phản ứng, tuy cấu trúc cơ chất thay đổi trong khi cấu trúc hốc phản ứng không biến đổi nhiều nhưng nhóm amin b ậc 4 luôn hướng vào vòng Trp(84) (hình . - Như vậy, dùng phương pháp ONIOM bước đầu đã khảo sát được cấu trúc c ủa tr ạng thái acetylcholine trong h ốc ph ản ứng khi chưa tạo phức, trạng thái phức gi ữa acetylcholine v à enzyme, c ấu trúc s ản ph ẩm choline được t ạo ra trong h ốc phản ứng và hiệu năng lượng của các trạng thái trên. - Ta có thể dùng phương pháp này để nghiên c ứu chi ti ết h ơ n đường ph ả n ứng. - S ử dụng các công cụ tính toán AutoDock, AutoDock Vina cùng với Gaussian, bước đầu đ ã thu được những kết quả phù hợp với thực nghiệm về phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzyme acetylcholinesterase.. - Bằng phương pháp QM/MM đã khảo sát được trạng thái phức giữa enzyme acetylcholinesterase v ới acetylcholine, vai trò của enzyme trong phả n ứng th ủy phân acetylcholine, trong đó có vai trò hóa học của tâm xúc tác và vai trò không gian, tĩnh điện của phần còn lại trong phân tử enzyme.. - Nh ững kết quả thu được đã mở ra hướng nghiên cứu chi tiết cơ chế phản ứng xúc tác c ủa enzyme acetylcholinesterase, từ đó có thể dự đoán được hoạt tính ức ch ế hay hoạt hóa của một số chất khác.. - Nghiên c ứu đầy đủ cơ chế phản ứng gồm các bước. - o Quá trình di chuyển của acetylcholine vào bên trong hốc phản ứng.. - o Quá trình di chuy ển từ trạng thái chưa liên kết trong hốc phản ứng đến tr ạng thái tạo phức.. - C ác bước trên sẽ được lập đường phản ứng chi tiết, tìm trạng thái chuyển tiếp, năng lượng hoạt hóa của mỗi giai đoạn.. - Nghiên c ứu phản ứng xúc tác của acetylcholinesterase thuộc các loài khác nhau m ột mặt làm sáng tỏ thêm ảnh hưởng của toàn bộ phân tử enzyme , m ột. - Từ kết quả về năng lượng thu được ở trên ta nhận thấy phương pháp QM/MM chưa thể giải thích được thỏa đáng hoạt tính xúc tác đặc biệt cao c ủa acetylcholinesterase. - Đặng Ứng V ận (2003), Động lực học các phản ứng hóa học, NXB Giáo d ục , Hà N ội