- BỞI DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP Paracoccus SP. - Phân hủy sinh học, Biochar, vi khuẩn Paracoccus sp. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá hiệu quả của một số phương pháp chủng vi khuẩn khác nhau lên khả năng phân hủy sinh học hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur trong môi trường đất. - Vi khuẩn phân hủy Propoxur, Paracoccus sp. - P23-7 phân lập từ mẫu đất nhiễm Propoxur, được chủng vào đất qua hai dạng: 1) dạng vi khuẩn tự do và 2) dạng vi khuẩn cố định trong biochar.. - Mật số vi khuẩn đất, khả năng sống sót của vi khuẩn Paracoccus sp. - Nghiệm thức chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - Dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 vẫn sống sót và phát triển trong đất ở điều kiện phòng thí nghiệm sau 14 ngày nuôi cấy ở tất cả các phương pháp chủng vi khuẩn. - Điều này được chứng minh thông qua điện di đồ DGGE về hình thái hệ vi khuẩn đất của các nghiệm thức thí nghiệm và của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - Vì vậy, kết quả nghiên cứu này cho phép kết luận rằng, việc ứng dụng một thể phức hợp gồm biochar và dòng vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất nông dược là phương pháp triển vọng nhất giúp gia tăng tốc độ phân hủy sinh học đối với độc chất hữu cơ trong môi trường đất.. - Kết quả cho thấy mật số vi khuẩn Azospirillum lipoferum (AZ 204) trong vật liệu biochar xơ dừa đạt cao nhất sau thời gian thí nghiệm (log CFU/g) ở ẩm độ 25,22%, ngoài ra, khả năng kích thích sinh trưởng lên cây đậu xanh của dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum (AZ 204) cố định trong vật liệu biochar xơ dừa cao hơn so với trường hợp cố định trong biochar vỏ trái bơ và lignite. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu: So sánh và đánh giá khả năng phân hủy thuốc trừ sâu Propoxur trong môi trường đất của dòng vi khuẩn phân lập Paracoccus sp. - P23-7 thông qua hai phương pháp chủng vi khuẩn: 1) vi khuẩn được cố định trước và được bảo vệ trong biochar và 2) phương pháp chủng vi khuẩn vào trong đất ở dạng tế bào tự do. - Kết quả nghiên cứu này giúp tìm ra phương pháp mới và hữu hiệu cho việc chủng vi khuẩn phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur vào trong môi trường đất nhằm mục đích xử lý sinh học đất ô nhiễm với Propoxur ở điều kiện thực tế ngoài đồng.. - quan sát sự phát triển vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng ở nghiệm thức bổ sung biochar dễ dàng hơn. - 2.2 Nguồn vi khuẩn. - 2.2.1 Chuẩn bị nguồn vi khuẩn. - P23-7 là dòng vi khuẩn được phân lập từ nền đất kho bảo quản hành tím ở khu vực canh tác hành tím tại Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng có hiệu quả rất cao trong phân hủy chuyên biệt hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur (Đỗ Hoàng Sang, 2014) được chọn cho bố trí thí nghiệm.. - Trước tiên, vi khuẩn được nuôi trong bình tam giác 100 mL chứa 25 mL dung dịch giàu dinh dưỡng Glucose Yeast Extract (GYE) trong 3 ngày trên máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút. - Sau đó, sinh khối vi khuẩn được thu hoạch bằng cách ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút. - Lặp lại 4 lần việc rửa sinh khối vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng nhằm loại bỏ hoàn toàn dinh dưỡng và nguồn carbon còn sót lại trong môi trường nuôi cấy. - Hiệu chỉnh độ đục của dung dịch chứa vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng bằng máy đo quang phổ về OD 600 nm x10 8 CFUs/mL). - Xác định mật số vi khuẩn của dung dịch chứa vi khuẩn dung để chủng vào trong đất bằng phương pháp đếm sống trên đĩa agar (Hoben và Somasegaran, 1982): Tiến hành pha loãng dung dịch vi khuẩn theo hệ số 10 với các nồng độ pha loãng khác nhau. - Hút 50 µL dung dịch vi khuẩn của mỗi nồng độ pha loãng và nhỏ 5 giọt lên trên bề mặt môi trường Tryptose Soybean Broth (TSB). - Các đĩa môi trường TSB chứa vi khuẩn được đặt vào túi nylon và ủ ở nhiệt độ 35 o C. - 2.2.2 Chủng vi khuẩn vào biochar. - Việc chủng vi khuẩn vào biochar được thực hiện theo quy trình sau: Bốn bình tam giác 100 mL, mỗi bình chứa: 1) 24 mL dung dịch khoáng tối thiểu chứa 40 ppm Propoxur (Ehrenstorfer GmbH, Đức), 2) 1 mL dung dịch vi khuẩn Paracoccus sp.. - Vào thời điểm bố trí thí nghiệm, toàn bộ 1,5 g biochar chứa vi khuẩn trong mỗi bình tam giác được rửa sạch nhằm loại bỏ vi khuẩn Papacoccus sp. - Biochar chứa vi khuẩn cố định bên trong đã sẵn sàng cho bố trí thí nghiệm trong đất. - Quy trình đếm mật số vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 cố định trong biochar được thực hiện như sau: Lấy một lượng xác định biochar sau khi rửa sạch chia làm hai phần trong điều kiện tiệt trùng: một phần với trọng lượng xác định dùng cho việc xác định ẩm độ biochar, phần còn lại với trọng lượng xác định dùng cho việc đếm mật số vi khuẩn Paracoccus sp.. - Sau đó, đếm mật số vi khuẩn hiện diện trên đĩa agar.. - độ, thành phần sa cấu, hàm lượng hữu cơ trong đất, đạm tổng số (Nts), lân tổng số (Pts), kali tổng số (Kts), và mật số vi khuẩn của mẫu đất thu thập. - Tổng mật số vi khuẩn của mẫu đất trước khi bố trí thí nghiệm là 0,64 x 10 7 CFUs/g đất. - Đất + 1% biochar (0,5 g) cố định sẵn vi khuẩn Paracoccus sp. - Tiếp theo, chủng vi khuẩn và biochar được chuẩn bị ở mục 2.2 theo từng nghiệm thức riêng biệt. - Mật số vi khuẩn chủng vào trong đất dưới dạng tự do là 0,5 x 10 5 CFU/g đất, trong khi vi khuẩn bị cố định trong. - biochar có mật số là 0,21 x 10 8 CFU/g biochar, dùng spatula trộn đều đất sau khi chủng vi khuẩn/biochar trong 2 phút. - 1) Mật số vi khuẩn có khả năng nuôi cấy trên môi trường agar giàu dinh dưỡng: vào các thời điểm 0, 3, 7 và 14 ngày thí nghiệm. - Mật số vi khuẩn đất thí nghiệm được xác định bằng phương pháp hòa loãng (Ian và Charles, 2004). - Các đĩa môi trường sau khi cho vi khuẩn vào được ủ trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Sau ba ngày ủ, tiến hành đếm mật số khuẩn lạc của vi khuẩn hiện diện trên bề mặt môi trường TSB. - Số khuẩn lạc đếm được sẽ được quy đổi theo hệ số pha loãng để có kết quả mật số vi khuẩn trong đất tại các thời điểm thu mẫu.. - 3) Đánh giá khả năng sống sót của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 trong đất sau khi được chủng vào đất: Phương pháp điện di biến tính tăng cấp DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) được ứng dụng để xác định khả năng sống sót của dòng vi khuẩn chủng vào đất và đa dạng quần thể vi sinh vật trong đất. - DNA của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 và của hệ vi khuẩn trong đất thí nghiệm được tách chiết bằng cách sử dụng CTAB 3% (Ihrmark và ctv., 2012), sau đó thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 341F-GC/534R. - 3.1 Diễn biến mật số vi khuẩn trong đất giữa các nghiệm thức trong thời gian thí nghiệm. - Kết quả diễn biến mật số vi khuẩn trong đất giữa các nghiệm thức trong 14 ngày bố trí thí nghiệm được trình bày ở Hình 1. - Nhìn chung, mật số vi khuẩn đất ở tất cả các nghiệm thức vào tất cả thời điểm lấy mẫu khá cao. - mật số vi khuẩn trong đất có xu hướng tăng nhanh vào giai đoạn 0 đến 3 ngày sau khi bố trí thí nghiệm, sau đó, ở giai đoạn 3 đến 7 ngày mật số có xu hướng giảm dần và cuối cùng mật số vi khuẩn trong đất đạt trạng thái ổn định trong giai đoạn từ 7 đến 14 ngày bố trí thí nghiệm.. - Mật số vi khuẩn đất vào thời điểm 3 ngày bố trí thí nghiệm đều tăng cao ở tất cả nghiệm thức. - Điều này có thể là do các điều kiện môi trường của thí nghiệm như nhiệt độ đất, ẩm độ đất và độ thoáng khí của đất được tối ưu vì vậy mật số vi khuẩn trong đất gia tăng nhanh ở tất cả các nghiệm thức sau khi thí nghiệm được bố trí. - Nghiệm thức 4 (chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - biochar) có mật số vi khuẩn cao nhất (log10 = 9,44 (CFU/1 g đất) và khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05). - Trong khi đó, các nghiệm thức còn lại không khác biệt thống kê khi so sánh với nhau về mật số vi khuẩn đất tại thời điểm xác định này. - Điều này cho thấy việc chủng dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 tự do kết hợp với bổ sung 1% biochar (dựa theo trọng lượng đất) vào trong đất giúp gia tăng mật số vi khuẩn đất.. - Việc tăng mật số vi khuẩn đất ở nghiệm thức 4 có thể giải thích một phần là do vi khuẩn Paracoccus sp. - Do đó, mật số vi khuẩn trong đất tăng lên. - So sánh mật số vi khuẩn đất vào thời điểm 7 ngày thí nghiệm cho thấy mật số ở nghiệm thức 5 (bổ sung 1% biochar có chứa sẵn vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7) có mật số cao hơn so với các nghiệm thức khác, nhưng chỉ thực sự khác biệt ý nghĩa thống kê với 2 nghiệm thức không bổ sung 1% biochar là: nghiệm thức 1 (đối chứng, không bổ sung biochar) và nghiệm thức 3 (chủng vi khuẩn. - Mật số vi khuẩn đất trước khi bố trí thí nghiệm là như nhau ở hai nghiệm thức 3 và 5 (0,64 x 10 7 CFUs/g đất), nghiệm thức 3 có bổ sung vi khuẩn Paracoccus sp.. - P23-7 dạng tự do (0,5 x 10 5 CFU/g đất) trong khi nghiệm thức 5 chỉ bổ sung 0,5 g biochar chứa 0,1 x 10 8 CFUs vi khuẩn Paracoccus sp. - Do đó, việc tăng mật số vi khuẩn đất ở nghiệm thức 5 có thể giải thích là do một phần vi khuẩn cố định trong bichar được phóng thích ra. - ngoài môi trường đất do đó mật số vi khuẩn đất gia tăng hoặc cũng có thể là do bản thân biochar có hiệu quả trong việc làm gia tăng mật số vi khuẩn trong đất. - Tuy nhiên, vào thời điểm 14 ngày thí nghiệm, mật số vi khuẩn ở nghiệm thức 5 chỉ cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 1 (đối chứng, không bổ sung biochar, p<0,05).. - Kết quả này cho thấy việc bổ sung 1% biochar vào trong đất có hiệu quả trong việc gia tăng mật số vi khuẩn đất vào thời điểm ban đầu của thí nghiệm.. - Hình 1: Diễn biến mật số vi khuẩn trong đất giữa các nghiệm thức trong 14 ngày thí nghiệm (n=4, độ lệch chuẩn). - Bên cạnh đó, nồng độ Propoxur còn lại trong đất ở hai nghiệm thức này ở thời điểm 7 và 14 ngày thí nghiệm đều cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê (p<0,01) so với 3 nghiệm thức còn lại có chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - Điều này cho thấy dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 thật sự là dòng vi khuẩn phân hủy chuyên biệt hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur không những. - Sau 3 ngày thí nghiệm chỉ duy nhất ở nghiệm thức 5 (chủng 1% biochar cố định sẵn vi khuẩn Paracoccus sp. - Kết quả này cho thấy việc chủng vi khuẩn Paracoccus sp.. - Việc phân hủy Propoxur trong đất không tương quan với mật số vi khuẩn trong đất ở ngày thứ 3 sau khi bố trí thí nghiệm là vì mặc dù mật số vi khuẩn ở các nghiệm thức hầu như tăng như nhau (Hình 1), nhưng chỉ duy nhất nghiệm thức 5 thể hiện khả năng phân hủy Propoxur cao. - Kết quả này được giải thích là do khi vi khuẩn Paracoccus sp.. - Vào thời điểm 7 và 14 ngày thí nghiệm nồng độ hoạt chất Propoxur trong đất không còn được phát hiện ở các nghiệm thức có chủng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 ở cả nghiệm thức chủng vi khuẩn ở dạng tế bào tự do hoặc bằng biochar, trong khi cả hai nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức 1 và 2) nồng độ hoạt chất Propoxur trong đất vẫn còn cao, nồng độ thấp nhất ở nghiệm thức 2 (bổ sung 1% biochar) là 62,62 ppm vào ngày 14 sau thí nghiệm. - Kết quả này cho thấy việc chủng dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 vào trong đất thật sự có hiệu quả rất cao trong việc làm gia tăng tốc độ phân hủy hoạt chất Propoxur trong đất, tuy nhiên hiệu quả sẽ gia tăng cao hơn nữa khi vi khuẩn được chủng bằng chất mang biochar.. - 3.3 Đánh giá khả năng sống sót của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - đánh giá khả năng sống sót của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - Kết quả phân tích về cấu trúc của hệ vi khuẩn trong mỗi nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Hình 3. - Kết quả cho thấy mẫu đất ban đầu không có sự hiện diện của dòng vi khuẩn phân hủy hoạt chất Propoxur, Paracoccus sp. - Việc bổ sung 75 ppm hoạt chất Propoxur vào trong đất thí nghiệm giúp gia tăng sự phát triển của nhóm vi khuẩn thuộc band 1, band 2 và band 3, đặc biệt là band 1 (do cường độ màu của band 1, 2 và 3 đậm hơn ở các Lane 2, 3, 4,. - Việc bổ sung dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 vào trong đất giúp gia tăng sự phát triển nhóm vi khuẩn thuộc band 1, 2 và 3, đặc biệt là band 2 và 3 (do cường độ màu của band 2 và 3 đậm hơn ở các Lane 4, 5 và 6 so với Lane 1, 2 và 3). - P23-7 được chứng minh là đã phát triển và sống sót cho đến thời điểm kết thúc thí nghiệm (14 ngày thí nghiệm) ở tất cả các nghiệm thức có chủng dòng vi khuẩn này vào đất (chủng dạng tế bào tự do hoặc cố định trong biochar) thông qua sự hiện diện band 4 trong mẫu ở các Lane 4, 5 và 6 khi so sánh và đối chiếu với đối chứng dương: DNA của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - Điều này cho thấy vi khuẩn Paracoccus sp. - Tóm lại, kết quả nghiên cứu này cho thấy dòng vi khuẩn phân hủy Propoxur, Paracoccus sp. - Lane 1: 0 ngày thí nghiệm, Lane 2: 14 ngày thí nghiệm, nghiệm thức 1 (đối chứng, không bổ sung biochar), Lane 3: 14 ngày thí nghiệm, nghiệm thức 2 (đối chứng, bổ sung 1% biochar), Lane 4: 14 ngày thí nghiệm, nghiệm thức 3 (bổ sung vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 dạng tự do), Lane 5: 14 ngày thí nghiệm, nghiệm thức 4 (bổ sung vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7 dạng tự do + 1% biochar), Lane 6: 14 ngày thí nghiệm, nghiệm thức 5 (bổ sung 1% biochar chứa sẵn vi khuẩn Paracoccus sp. - P23-7), Lane 7: DNA của dòng vi khuẩn Paracoccus sp. - Việc chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp.. - Dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp. - Biochar có chức năng như là chất mang rất hữu hiệu dùng để chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy hoạt chất thuốc trừ sâu Propoxur, Paracoccus sp.. - P23-7 vào trong môi trường đất, biochar còn giúp bảo vệ vi khuẩn cố định bên trong sống sót trong điều kiện bất lợi của môi trường, và một số vi khuẩn có thể phóng thích và du nhập ra ngoài môi trường đất từ biochar để thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tham gia vào chức năng phân hủy Propoxur trong môi trường đất.. - Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn bản địa phân hủy chuyên biệt hoạt chất propoxur từ nền đất bảo quản hành tím tại thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng