- HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ CAO CHIẾT THẢO DƯỢC KHÁNG VI KHUẨN GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI. - Nghiên cứu được tiến hành nhằm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của bảy loại chất chiết thảo dược (thầu dầu, lưỡi rắn, mật gấu, chùm ngây, lược vàng, ô rô và sài đất) với nguyên liệu được thu ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long. - Kết quả ghi nhận: Bảy loại cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn khác nhau, trong đó cao chiết thầu dầu (Ricinus communis L.) cho hiệu quả cao nhất với đường kính vòng vô khuẩn 17 - 18 mm, kế đến là cao chiết mật gấu (Vernonia amygdalina del. - Ngược lại, đường kính vòng vô khuẩn thấp nhất trên cả hai chủng vi khuẩn thu được từ dịch chiết cây lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa L.) và lược vàng (Callisia fragrans) với vòng kháng khuẩn tương ứng là 7 mm và 8 mm. - Kết quả cũng được xác định hiệu quả ở cao chiết thầu dầu đối với V. - Hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết thảo dược kháng vi khuẩn gây bệnh ở tôm nuôi. - Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã xác định hiệu quả của việc sử dụng chiết xuất thảo dược giúp tôm, cá tăng trưởng tốt, tăng cường hệ miễn dịch và ức chế vi khuẩn gây bệnh (Citarasu, 2010. - Nhiều loại thảo dược đã được xác định có hoạt tính sinh học cao cũng như có khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, ký sinh trùng, kích thích tăng trưởng, kích thích tuyến sinh dục thành thục, chống stress, tăng cường miễn dịch (Citarasu, 2010). - Một nghiên cứu về thảo dược ở Trung Quốc cho thấy cao chiết từ năm loại thảo dược (Stellaria aquatica, Impatiens Biflora, Oenothera biennis, Artemisia vulgaris và Lonicera japonica) có khả năng chống lại 13 loại vi khuẩn gây bệnh cá, đặc biệt là vi khuẩn Aeromonas salmonicida và Edwardsiella ictaluri (Shangliang et al., 1990). - Cây quế đã được xác định có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn A. - Ở Ấn Độ, chiết xuất Rosmarinus officinalis được dùng trị bệnh cho cá rô phi (Oreochromis sp.) bị nhiễm Streptococcus (Abutbul et al., 2004), hay chiết xuất hạnh nhân được dùng trị ký sinh trùng và vi khuẩn A.. - Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng thảo dược trên tôm. - Năm 2010, Guo et al., đã sàng lọc nhiều loại thảo dược nhằm chống lại vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng, trong đó có 26 loại thảo dược được khảo sát, kết quả cho thấy khi kết hợp nhiều loại thảo dược cho hoạt tính kháng khuẩn cao hơn so với dùng đơn. - Ở Việt Nam, tác dụng diệt khuẩn của cao chiết lá sim và hạt sim (Rhdomyrtus tomentosa) đã được xác định đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính với kết quả đường kính vòng vô khuẩn đạt được là 17,67 mm đối với chủng V. - Cao chiết methanol cây cỏ mực cũng được thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn với 12 chủng vi khuẩn Vibrio spp. - Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cỏ mực được thực hiện ở các nồng độ . - Hiệu quả kháng khuẩn ghi nhận ở 10/12 chủng vi khuẩn phân lập, trong đó nồng độ 8 µg/mL cho đường kính vòng kháng khuẩn đạt 30,3 mm đối với chủng G5, chủng được xác định có tỉ lệ tương đồng 99% với V. - Tuy nhiên, ở Việt Nam, thông tin khoa học về việc sử dụng chiết xuất thảo dược ức chế vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi vẫn còn hạn chế. - 2.1 Nguồn thảo dược. - Nghiên cứu được thực hiện trên bảy loại thảo dược ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long bao gồm:. - Cây thảo dược được rửa sạch, sấy khô ở 60 o C và nghiền thành bột. - Bột thảo dược ngâm với methanol có tỉ lệ 1:10 trong 3 ngày. - được xác định là % hiệu suất chiết xuất thảo dược và được xác định bằng công thức (Turker et al., 2009):. - 2.2 Nguồn vi khuẩn. - Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất thảo dược được chọn từ bộ sưu tập của Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.. - Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường Nutrient agar bổ sung 1,5% NaCl (NA-1,5% NaCl) sau đó tái định danh lại bằng phương pháp PCR. - Qui trình PCR phát hiện vi khuẩn V.. - 2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn. - Vi khuẩn (V. - parahaemolyticus) được nuôi trong môi trường Nutrient broth có bổ sung 1,5% NaCl (NB-1,5% NaCl) và ủ ở 28 o C trong 24 giờ, sau đó điều chỉnh mật số vi khuẩn bằng với McFarland 0.5. - Vi khuẩn được trãi trên môi trường NA-1,5% NaCl. - Đặt các đĩa giấy đã được tẩm cao chiết xuất thảo dược lên đĩa môi trường có vi khuẩn, sau đó ủ ở 28 o C trong 24 giờ. - Mỗi loại thảo dược và loài vi khuẩn được lặp lại 3 lần. - Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược được xác định bằng cách đo đường kính của vùng ức chế tăng trưởng của vi khuẩn (Oometta-aree et al., 2006).. - Chọn cao chiết xuất thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn nhạy để thực hiện khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). - Vi khuẩn V. - Điều chỉnh mật số vi khuẩn bằng với McFarland 0.5, sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn 100 lần. - Mỗi chiết xuất thảo dược được pha loãng. - bằng methanol với tỉ lệ và cho vào môi trường lỏng NB-1,5% NaCl có chứa vi khuẩn và ủ ở 28 o C trong 24 giờ. - Mỗi loại thảo dược kết hợp với vi khuẩn được lặp lại 2 lần. - MIC của chiết xuất thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất của chiết xuất trong môi trường lỏng không có vi khuẩn phát triển (Oometta-aree et al., 2006).. - Trong thử nghiệm MIC, các độ pha loãng thảo dược ức chế sự phát triển của vi khuẩn được sử dụng để kiểm tra nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch TCBS. - Mỗi loại thảo dược kết hợp với vi khuẩn được lặp lại 3 lần. - MBC của chiết xuất thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất của chiết xuất trong môi trường lỏng không có vi khuẩn phát triển (Oometta-aree et al., 2006).. - 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược đối với vi khuẩn V. - Chủng vi khuẩn V. - Do đó, hai chủng vi khuẩn này được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của bảy loại cao chiết thảo dược.. - Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR đối với 2 chủng vi khuẩn Vibrio (A) Vi khuẩn V. - (B) Vi khuẩn V. - Cao chiết thảo dược được thu hồi thông qua hệ thống cô quây chân không. - Hiệu suất chiết xuất được xác định dựa vào khối lượng cao chiết thu được sau khi loại bỏ hoàn toàn dung môi methanol.. - Bảng 1: Hiệu suất chiết xuất của cao chiết thảo dược. - Thảo dược Tên khoa học Khối lượng thảo dược bột khô (g). - Khối lượng thảo dược chiết xuất (g). - Như vậy, những loại thảo dược khác nhau cho kết quả khối lượng cao chiết thảo dược và hiệu suất chiết xuất khác nhau. - Đặc biệt, đối với hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược thì việc sử dụng dung môi cồn (methanol, ethanol) sẽ cho hiệu quả cao hơn so với chiết xuất bằng nước (Turker et al., 2009), hay hexane, ethyl axetat (Rosell and Srivastava, 1987;. - (2009) cho thấy, cao chiết thảo dược được chiết xuất bằng ethanol, methanol sẽ có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nước, ở cả vi khuẩn Gram âm, Gram dương. - rằng các cao chiết này rất có tiềm năng trong việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.. - Methanol là dung môi phân cực cao, có khả năng hòa tan được những hợp chất tự nhiên có trong thảo dược (El-Mahmood and Doughari, 2008). - Bảy loại cao chiết thảo dược được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn với hai chủng vi khuẩn Vibrio spp. - Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược đối với vi khuẩn V. - Bảng 2: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược đối với vi khuẩn V. - Cao chiết Đường kính vòng kháng khuẩn (mm). - Kháng sinh cefotaxime (CTX): 30 µg Hầu hết các loại cao chiết thảo dược dùng trong. - Nhóm cao chiết mật gấu, chùm ngây, ô rô, sài đất có khả năng kháng V. - kính vòng kháng khuẩn ≥ 10 mm), trong khi lưỡi rắn và lược vàng thì gần như không thể hiện được hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn này (Hình 2). - parahaemolitycus, nhóm cao chiết mật gấu, chùm ngây, ô rô, sài đất cho thấy hiệu quả thấp hơn (đường kính vòng kháng khuẩn mm), cây lưỡi rắn và lược vàng cũng cho hiệu quả tương tự 7,0 mm và 7,5 mm (Hình 3).. - Hình 2: Hoạt tính kháng vi khuẩn V. - harveyi của các loại dịch chiết thảo dược. - A: cao chiết thầu dầu, B: cao chiết lưỡi rắn, C: cao chiết mật gấu, D: cao chiết chùm ngây, E: cao chiết lược vàng, F:. - cao chiết ôrô, G: cao chiết sài đất, Me-OH: methanol, CTX: cefotaxime (30µg). - Hình 3: Hoạt tính kháng vi khuẩn V. - parahaemolyticus của các loại dịch chiết thảo dược A: cao chiết thầu dầu, B: cao chiết lưỡi rắn, C: cao chiết mật gấu, D: cao chiết chùm ngây, E: cao chiết lược vàng, F:. - cao chiết ôrô, G: cao chiết sài đất, Me-OH: methanol, CTX: cefotaxime (30µg) Kết quả cho thấy các hợp chất tự nhiên được. - chiết xuất từ thảo dược có khả năng kháng khuẩn.. - Nghiên cứu của Hussain and Kumaresan (2013) đã chứng minh được hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Bacillus, Klebisella, Escherichia coli, Proteus, Staphylococcus aureus và Pseudomonas) của cao chiết cây lưỡi rắn, hay khả năng ức chế và kháng lại vi khuẩn Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri và Staphylococcus aureus của cao chiết cây từ bi (Blumea balsamifera LINDL.) (Huỳnh Kim Diệu và Nguyễn Thị Cẩm Quyên, 2016). - Tuy nhiên, một số hợp chất chiết xuất từ tự nhiên chỉ có thể diệt được một nhóm loại vi khuẩn, cụ thể như chiết xuất có chứa 1'-acetoxyeugugenol acetate có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus cerevisiae, S. - aureus và Bacillus cereus), nhưng không ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Gram âm (Salmonella spp., E. - (2013) đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn V. - harveyi của cao chiết lá ô rô (Acanthus ilicifolius) ở dạng cao thô sau đó được phân đoạn trong các loại dung môi như n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, ethanol và methanol với. - Kết quả cho thấy cao chiết lá ô rô ở phân đoạn ethyl acetate, ở dạng chiết xuất thô và ở phân đoạn n-butanol cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất, với đường kính kháng khuẩn đạt tương ứng 12 mm, 11,33 mm và 11 mm. - (2004), cao chiết thầu dầu có khả năng kháng vi khuẩn V. - Tuy nhiên, ở báo cáo này, nhóm tác giả không đề cập đến nồng độ cao chiết xuất thầu dầu dùng để thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. - 3.2 MIC và MBC của thảo dược đối với vi khuẩn V. - Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn cho thấy cao chiết thầu dầu kháng tốt (nhạy) đối với hai. - chủng vi khuẩn V. - parahaemolitycus gây bệnh trên tôm, cho nên cao chiết thầu dầu sẽ được sử dụng để tiếp tục xác định MIC và MBC. - Kết quả Bảng 3 cho thấy cao chiết từ cây thầu dầu có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn V.. - Bảng 3: Kết quả MIC và MBC của chất chiết thầu dầu đới với vi khuẩn V. - Vi khuẩn MIC (mg/ml) MBC (mg/ml) MBC/MIC. - Từ kết quả nghiên cứu MIC và MBC, chất chiết thầu dầu có khả năng diệt được vi khuẩn V. - (2011), cao chiết ethanol nghệ có nồng độ ức chế tối thiểu đối với V. - Bện cạnh đó, dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu mà nhóm tác giả còn cho rằng khi bổ sung cao chiết ethanol nghệ với một tỉ lệ 15 g/kg thức ăn sẽ giúp gia tăng tỉ lệ sống của tôm thẻ chân trắng chống lại vi khuẩn V. - Thầu dầu được dùng làm chất giàu hóa cho Artemia, sau đó dùng làm thức ăn cho ấu trùng tôm Peneaus indicus nhằm chống lại mầm bệnh vi khuẩn V. - Naz and Bano (2012) đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của các cao chiết lá cây thầu dầu từ các dung môi methanol, ethanol và nước, kết quả khảo sát cho thấy cao chiết thầu dầu có tiềm năng kháng lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương (S. - Ngoài ra, thông qua các nghiên cứu trong ống nghiệm, Kamel (2001) còn cho rằng nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh có liên quan đến nồng độ hoạt chất và độ tinh khiết của chiết xuất.. - communis L.) có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trong bảy loại chất chiết thảo dược được khảo sát. - Khả năng kháng khuẩn của chất chiết thầu dầu đối với vi khuẩn V. - Do đó, thông qua các kết quả đạt được, cao chiết thầu dầu có thể sử dụng như một chất có khả năng diệt khuẩn và có tiềm năng là nguồn thực phẩm giúp tôm nuôi tăng cường khả năng kháng vi khuẩn V. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cỏ mực (Eclipta alba) đối với vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 37(1se): 261-266.. - Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết lá sim và hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ. - Phát hiện vi khuẩn Vibrio harveyi và Streptococcus agalactiae bằng phương pháp PCR khuẩn lạc