- HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ CHẤT CHIẾT THẢO DƯỢC KHÁNG Vibrio parahaemolyticus VÀ Vibrio harveyi GÂY BỆNH Ở TÔM BIỂN. - Chất chiết thảo dược, hoạt tính kháng khuẩn, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, nồng độ ức chế tối thiểu, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thảo dược trên vi khuẩn gây bệnh tôm - Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi. - Hoạt tính kháng khuẩn, nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của các chất chiết xuất với vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch và phương pháp pha loãng đa nồng độ. - Kết quả ghi nhận: (i) chất chiết diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria), lựu (Punica granatum) và trà xanh (Camellia sinensis) có khả năng ức chế đồng thời V. - (ii) chất chiết hồng ri (Cleome spinosa) và hoa ngũ sắc (Agerantun conyzoides) chỉ có hoạt tính kháng khuẩn V. - Bên cạnh đó, chất chiết tra (Thespesia populnea), tía tô (Perilla frutescens), cỏ lào (Chromlacna odorata), đu đủ (Carica papaya) và chùm ngây (Moringa oleifera) không có hoạt tính kháng V. - (iii) Chất chiết diệp hạ châu thân đỏ được xác định có chứa alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tanins và sesquiterpene lactones. - Hoạt tính kháng khuẩn của một số chất chiết thảo dược kháng Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi gây bệnh ở tôm biển. - Trong thảo dược có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, phổ kháng khuẩn rộng đối với nhiều tác nhân gây bệnh và không gây ra hiện tượng kháng khuẩn. - Các hợp chất được tìm thấy trong thực vật có khả năng kháng khuẩn bao gồm alkaloids, glycosides, polyphenols, và terpenes (Ahn, 2017).. - Trên cơ sở đó, nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định khả năng kháng một số loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở tôm nuôi của một số chất chiết xuất thảo dược thu hái ở vùng ĐBSCL. - 2.1 Chất chiết thảo dược. - Chất chiết thảo dược được pha loãng trong dung môi DMSO (400 mg/mL), tẩm vào đĩa giấy có đường kính 8 mm, để khô và sử dụng cho bước phân tích hoạt tính kháng khuẩn.. - 2.2 Nguồn vi khuẩn. - Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất thảo dược từ bộ sưu tập của bộ môn Bệnh học Thủy sản, khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.. - Nguồn vi khuẩn V. - 2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng để xác định khả năng kháng khuẩn của thảo dược.. - Đặt các đĩa giấy đã được tẩm chất chiết thảo dược lên đĩa môi trường có vi khuẩn, sau đó ủ ở 28°C trong vòng 24 giờ. - Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược được xác định bằng cách đo đường kính của vòng kháng khuẩn của vi khuẩn (Oonmetta-aree et al., 2006).. - Hai chất chiết thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất được chọn để xác định nồng độ ức. - Vi khuẩn V. - Mỗi chất chiết xuất thảo dược được pha loãng với tỉ lệ và cho vào môi trường lỏng NB-1,5% NaCl có chứa vi khuẩn và ủ ở 28 o C trong 24 giờ. - MIC của chất chiết thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất của chiết xuất trong môi trường lỏng không có vi khuẩn phát triển (Oometta-aree et al., 2006).. - MBC của chiết xuất thảo dược được xác định là nồng độ thấp nhất của chiết xuất trong môi trường lỏng không có vi khuẩn phát triển (Oometta-aree et al., 2006).. - 2.6 Định tính và định lượng một số thành phần hóa học trong chất chiết diệp hạ châu thân đỏ. - Hàm lượng polyphenols tổng trong chất chiết diệp hạ châu thân đỏ được xác định bằng thuốc thử. - Cụ thể, thể tích 0,25 mL chất chiết diệp hạ châu (50 μg/mL) được cho vào ống eppendorf với 0,25 mL nước cất và 0,25 mL dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc mạnh rồi để yên năm phút cho ổn định. - Hàm lượng flavonoids tổng trong chất chiết diệp hạ châu thân đỏ được xác định theo mô tả của Zhishen có hiệu chỉnh (Zhishen et al., 1999). - Cụ thể, mẫu chất chiết được pha với ethanol đạt nồng độ 200 μg/mL. - 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược đối với vi khuẩn V. - Hoạt tính kháng khuẩn V. - parahaemolyticus của các chất chiết thảo dược được đánh giá thông qua phương pháp khuếch tán đĩa thạch. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại chất chiết thảo dược được trình bày ở Bảng 1.. - Bảng 1: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại chất chiết thảo dược đối với vi khuẩn V. - parahaemolyticus gây bệnh trên tôm Tên chất chiết Bộ phận. - cây Tên khoa học Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) V. - parahaemolyticus Diệp hạ châu thân đỏ Lá Phyllanthus urinaria L. - Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn (Bảng 1, Hình 1) ghi nhận có 3/10 loại chất chiết thảo dược có khả năng ức chế cả hai loài vi khuẩn (V.. - harveyi) gây bệnh trên tôm, bao gồm chất chiết diệp hạ châu thân đỏ, lựu và trà xanh. - Trong đó, chất chiết diệp hạ châu thân đỏ có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng đạt 19,7 mm cho V. - parahaemolyticus (so với doxycycline mm), kế đến là chất chiết lựu có đường kính kháng V. - parahaemolyticus là 20,7 mm, và chất chiết trà xanh có đường kính kháng V. - Chất chiết diệp hạ châu (P. - urinaria) từ lá, thân và rễ đã được công bố có khả năng kháng khuẩn được cả vi khuẩn gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, V. - Về tác dụng dược học, diệp hạ châu thân đỏ được xác định có khả năng chống ung thư, bảo vệ gan, chống đái tháo đường, kháng khuẩn và tác dụng bảo vệ tim mạch (Geethangili and Ding, 2018). - Tương tự, chất chiết lựu cũng thể hiện được khả năng kháng vi khuẩn cao và được ghi nhận hiệu quả trong y học cổ truyền ở các khu vực thuộc Mỹ, châu Âu, châu Phi và châu Á (Olapour and Najafzadeh, 2010). - Các bộ phận khác nhau của cây lựu (vỏ và rễ) có chứa tanin, alkaloid và polyphenol, các hợp chất này có hoạt động kháng khuẩn mạnh (Ahmad and Beg, 2001. - (2001) chất chiết vỏ lựu từ dung môi methanol có khả năng kháng khuẩn đối với E. - aeruginosa tốt hơn trong các dung môi khác (nước, diethyl ether), với đường kính vòng kháng khuẩn 13 - 20 mm. - Tương tự, chất chiết methanol từ vỏ lựu ở nồng độ 25 µg và 50 µg được xác định có khả năng kháng với vi khuẩn gram dương (S. - aureus) và vi khuẩn gram âm (P. - Hình 1: Khả năng kháng vi khuẩn V. - parahaemolyticus của một số chất chiết thảo dược (A) Diệp hạ châu, (B) Lựu, (C) Chùm ngây, (D) Trà xanh, (E) Hồng ri, (G) Cỏ lào, (F) Cỏ hôi, (H) Tra, (I) Tía tô, (J) Đu đủ. - Chất chiết trà xanh cũng được ghi nhận có hiệu quả kháng nhiều loài vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản (Toda et al., 1989. - Cụ thể, dịch chiết trà xanh có khả năng ức chế vi khuẩn V. - parahaemolyticus với đường kính vòng kháng khuẩn từ 14,4 đến 16,4. - Tuy nhiên, kết quả ghi nhận ở Bảng 1 cho thấy nhóm chất chiết từ cây hồng ri, hoa ngũ sắc chỉ có khả năng kháng với một trong hai loài vi khuẩn khảo sát với hoạt tính kháng khuẩn trung bình (11-12 mm).. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cũng ghi nhận chất chiết cỏ lào thể hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu. - Riêng chất chiết từ tra, tía tô, đu đủ và chùm ngây không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với V. - Chất chiết từ đu đủ và chùm ngây không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với V. - chất chiết tra, tía tô, đu đủ, chùm ngây không thể hiện hiệu quả về hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio spp. - Hiệu quả kháng khuẩn của chất chiết thảo dược có thể tùy thuộc vào loài thực vật, bộ phận cây sử dụng chiết xuất và dung môi chiết xuất. - Chất chiết từ rễ đu đủ bằng methanol có chứa nhiều hợp chất (saponins, alkaloids, tannin và phenol) trong khi chất chiết với dung môi acetone chứa saponin, glycoside và chất chiết trong nước chỉ chứa glycoside (Doughari et al., 2007).. - Bảng 2: Hoạt tính kháng khuẩn của các loại chất chiết thảo dược đối với vi khuẩn V. - harveyi Mẫu Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Diệp hạ châu. - Tiếp tục thử nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của chất chiết diệp hạ châu và lựu trên năm chủng vi khuẩn V. - Kết quả Bảng 2 cho thấy chất chiết diệp hạ châu thân đỏ có khả năng ức chế năm chủng vi khuẩn V. - harveyi với đường kính vòng vô khuẩn cao hơn so với chất chiết lựu. - Kết quả này tương tự với kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.. - Tóm lại, từ kết quả sàng lọc khả năng kháng khuẩn từ 10 loại thảo dược cho thấy chất chiết diệp hạ châu, lựu, trà xanh cho kết quả tốt nhất, có khả năng kháng đồng thời cả hai loài Vibrio spp. - gây bệnh trên tôm với đường kính vòng kháng khuẩn rộng.. - 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của chất chiết diệp hạ châu và lựu đối với vi khuẩn V. - Chất chiết diệp hạ châu và lựu có hoạt tính kháng khuẩn cao được chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) đối với V. - Kết quả ghi nhận: chất chiết diệp hạ châu và lựu có khả năng ức chế vi khuẩn V. - Kết quả MBC cho thấy chất chiết diệp hạ châu và lựu có hiệu lực kìm khuẩn, V. - Theo Canillac and Mourey (2001), tỷ lệ MBC/MIC nhỏ hơn hoặc bằng 4, chất chiết có khả năng diệt khuẩn. - Kết quả nghiên cứu cho thấy chất chiết diệp hạ châu và lựu có khả năng kìm khuẩn V. - Kamel (2001) cho rằng nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh có liên quan đến nồng độ hoạt chất và độ tinh khiết của chất chiết.. - Bảng 3 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của diệp hạ châu và lựu. - Diệp hạ châu thân đỏ gt;4. - Kết quả tương tự cũng được ghi nhận qua khảo sát so sánh hiệu quả diệt khuẩn giữa chất chiết xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) và diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) (Direkbusarakom et al., 1998). - Trong đó, giá trị MIC trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila của chất chiết xuyên tâm liên và diệp hạ châu giống nhau với cùng nồng độ từ 2,5 mg/mL đến 10 mg/mL. - Tuy nhiên, khả năng ức chế vi khuẩn V. - harveyi của chất chiết diệp hạ châu cao hơn so với chất chiết xuyên tâm liên về số lượng chủng được ức chế. - Cụ thể, diệp hạ châu với MIC = 5 mg/ml và 10 mg/mL có khả năng ức chế lần lượt là hai và chín chủng vi khuẩn. - Chất chiết xuyên tâm liên ở nồng độ MIC = 5 mg/ml ức chế 1 chủng và MIC = 10 mg/ml ức chế bảy chủng. - Bảng 4: Kết quả định tính thành phần hóa học trong chất chiết diệp hạ châu thân đỏ. - Chất chiết diệp hạ châu thân đỏ có kết quả hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất nên được chọn để định tính và định lượng một số thành phần hóa học. - Kết quả ghi nhận chất chiết diệp hạ châu thân đỏ có chứa các thành phần như alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tanins và sesquiterpene lactones (Bảng 4). - Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol và flavonoid trong chất chiết diệp hạ châu thân đỏ có hàm lượng cao. - Các hợp chất alkaloids, glycosides, polyphenols, và terpenes chiết xuất từ thực vật đã được xác định có khả năng kháng khuẩn (Ahn, 2017). - Do vậy, kết quả định tính và định lượng một số thành phần hóa học giúp giải thích thêm về kết quả hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất của chất chiết diệp hạ châu thân đỏ.. - Thông qua các kết quả đạt được, chất chiết diệp hạ châu và lựu có thể sử dụng như chất có khả năng kìm khuẩn và có tiềm năng là nguồn dược chất giúp tôm nuôi tăng khả năng kháng vi khuẩn Vibrio spp. - Chất chiết diệp hạ châu thân đỏ (P. - sinensis) chiết xuất bằng dung môi methanol có khả năng kháng đồng thời hai loài vi khuẩn thường gây bệnh cho tôm nuôi (V. - Chất chiết diệp hạ châu thân đỏ có hoạt tính kháng V. - Chất chiết lựu có hoạt tính kháng V. - Các chất chiết hồng ri (Cleome spinosa), hoa ngũ sắc (Agerantun conyzoides), cỏ lào (Chromlacna odorata), tra (Thespesia populnea), tía tô (Perilla frutescens), đu đủ (Carica papaya), chùm ngây (Moringa oleifera) không có hoạt tính kháng khuẩn V. - Chất chiết diệp hạ châu thân đỏ được xác định có chứa các thành phần hóa học alkaloids, flavonoids, steroid và triterpenoids, đường khử, tanins và sesquiterpene lactones. - parahaemolyticus của tôm biển khi cho ăn thức ăn bổ sung chất chiết từ diệp hạ châu và lựu.