- KHẢ NĂNG CHỊU MẶN VĂ ĐA DẠNG DI TRUYỀN PROTEIN DỰ TRỮ CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA TRỒNG VEN BIỂN. - VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG. - Câc giống lúa được thu thập ở vùng ven biển của câc tỉnh Bến Tre, Long An, Tiền Giang vă Tră Vinh. - Đặc tính khâng mặn được đânh giâ bằng phương phâp điện di DNA với primer RM223 vă đa dạng protein dự trữ được đânh giâ bằng điện di SDS-PAGE. - Kết quả thí nghiệm cho thấy có 6 giống lúa thể hiện băng DNA giống như giống chuẩn khâng mặn (Đốc Phụng) vă 11 giống thể hiện băng DNA tương tự như giống chuẩn nhiễm mặn (IR28). - Giống lúa vùng ven biển đa dạng kiểu hình (H o. - đa dạng kiểu gen (H EP ) vă tổng số allele có hiệu quả ở mỗi locus cũng đa dạng. - Điều nầy cho thấy giống lúa vùng ven biển Đồng Bằng Sông Cửu Long đa dạng di truyền về protein dự trữ, vì vậy chọn lọc dòng thuần chịu mặn vă hăm lượng protein cao lă có hiệu quả.. - Cũng từ những hạn chế trín, phần lớn người dđn chỉ thực hiện việc chọn giống qua chọn lọc trong tự nhiín, mặc dù vậy họ cũng đê phât hiện chọn lọc lưu giữ sản xuất được một số giống lúa mùa có năng suất cao vă chịu mặn theo từng vùng. - Câch lăm năy trải qua thời gian dăi đê hình thănh nín những giống lúa mới có khả. - năng chống chịu mặn giỏi. - Ngăy nay với yíu cầu giống ngắn ngăy, cho năng suất cao, chịu mặn giỏi, đồng thời có phẩm chất ngon (Bùi Chí Bửu et al, 2000) thì nguồn giống được người dđn chọn lọc lđu đời đê trở thănh nguồn gen qủ vă lă yếu tố cần thiết mă bất kỳ nhă chọn tạo giống năo cũng phải quan tđm. - Đânh giâ khả năng chịu mặn ở mức độ phđn tử ADN (Nguyen Thi Lang et al, 2001) trín câc giống chịu mặn cũng đê được nhiều công trình gần đđy công bố.. - Mục tiíu nghiín cứu của đề tăi lă “Đânh giâ khả năng chịu mặn vă đa dạng di truyền protein dự trữ của câc giống lúa trồng ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long” nhằm khai thâc vốn gen qủ, phục vụ cho công tâc chọn tạo giống.. - Bộ giống lúa gồm câc giống được trồng ven biển tại câc tỉnh Long An, Bến Tre, Tiền Giang, vă Tră Vinh đê được thu thập tại ruộng của nông dđn trong hai năm 2000 vă 2001.. - Ngoăi ra, hai giống lúa đối chứng được sử dụng lă giống Đốc Phụng, chuẩn khâng mặn vă IR28, giống chuẩn nhiễm mặn được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long trong năm 2002 (Nguyen thi Lang et al,2001).. - Bảng 1: Danh sâch câc giống lúa trồng ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long Mê số. - Bộ điện di protein: EPS 250. - 2.2.1 Điện di DNA bằng phương phâp SSR hay Microsattelite (a) Điện di DNA bằng bằng phương phâp microsattelite. - (i) Cắt 2cm lâ vă cho văo 500µl acid citric 5% nghiền mịn, ly tđm 7000vòng/5 phút, thím 500µl acid citric 5% ly tđm 30 giđy, thím văo 400µl dung dịch lysis buffer;. - (iv) Thím văo dung dịch 400µl Isopropanol, ly tđm 12.000 vòng/phút;. - (v) Thím văo 500µl dung dịch ethanol 70%, ly tđm 12.000 vòng/phút;. - (vi) Phơi khô mẫu, cho văo 20µl dung dịch TE, ủ 5 phút ở nhiệt độ 50 o C;. - Dung dịch đệm (loading buffer (10X. - (x) Lấy 1µl dung dịch loading buffer, cho văo 5µl DNA, cho văo gel agarose. - Mở điện vă định thời gian điện di, nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide, chụp hình gel bằng mây (UV) hoặc chạy điện di bằng polyacrylamide vă nhuộm trong dung dịch nitrate bạc.. - 2.2.2 Phđn nhóm khả năng chịu mặn. - Dựa trín phổ điện di ADN, câc giống lúa đê được phđn nhóm chống chịu mặn hay nhiễm mặn khi có chiều dăi ADN của chúng bằng với chiều dăi phđn tử của giống đối chứng khâng (Đốc Phụng) hay nhiễm mặn (IR28).. - 2.2.3 Đa dạng di truyền protein dự trữ. - Khảo sât protein thănh phần bằng phương phâp điện di một chiều theo phương phâp Laemmli (1970). - Bước 1: Chuẩn bị dung dịch. - Dung dịch ly trích chứa (0,2% SDS. - dung dịch đệm điện di (0,025 M Tris. - Lấy 3 mg bột nội nhũ nghiền, thím 100 l dung dịch ly trích, lắc, ly tđm 12.000 vòng / phút trong 3 phút. - Pha dung dịch gel 5% theo Sambrook, để cho gel đông. - Đổ dung dịch văo bộ gel, tạo giếng chứa dung dịch. - Đặt bộ gel văo hộp điện di vă cho dung dịch đệm điện di văo;. - Bước 4: Điện di. - Cho 10l dung dịch ly trích mẫu văo câc giếng của gel, thím dung dịch đệm điện di, điều chỉnh hiệu điện thế ở 40V. - Điện di khoảng 3 - 4 giờ. - Đọc kết quả.. - 2.2.4 Độ đa dạng di truyền. - Độ đa dạng di truyền của protein dự trữ được ghi nhận tùy theo mức độ ăn mău phẩm nhuộm CBB-R250. - H o : Giâ trị đa dạng di truyền kiểu hình được tính theo công thức:. - H EP : Giâ trị đa dạng di truyền kiểu gen được tính theo công thức:. - 3 KẾT QUẢ VĂ THẢO LUẬN 3.1 Đânh giâ khả năng chịu mặn. - Kết quả phđn tích điện di DNA trín lâ lúa bằng phương phâp PCR (Polymerase Chain Reaction) microsatellite với primer 223 cho thấy:. - Giống Nếp Ruồi, Trắng Tĩp, Lem Bụi vă Lúa Că Mau có băng DNA tương đồng với băng DNA với giống Đốc Phụng, có khả năng chống chịu mặn. - Câc giống Nếp Lâ Hẹ, Nếp 4 Thâng, Nếp Sâp, Nếp Bă Giă, Bảy Hóa vă Thanh Tră có băng DNA tương đồng với băng DNA của giống IRR28, không có khả năng chống chịu mặn (Hình 1a).. - Giống Rạch Giâ có băng DNA tương đồng với băng DNA của giống Đốc Phụng, thể hiện tính chống chịu mặn vă giống Bông Hường có băng DNA tương đồng với băng DNA của giống IR28, thể hiện khả năng nhiễm mặn (Hình 1b).. - Ngoăi ra, trín phổ điện di DNA chúng tôi cũng ghi nhận có thể hiện băng DNA của một số câ thể nằm trong khoảng giữa băng DNA của giống Đốc Phụng vă IR28: khâc với giống Nếp Ruồi có băng DNA tương đồng với băng DNA của giống Đốc Phụng, thể hiện tính chống chịu mặn. - giống U17, Nếp Lâ Hẹ có băng DNA tương đồng với băng DNA của giống IR28, thể hiện khả năng nhiễm mặn. - Hình 1: Phổ điện di DNA: (a) của 11 giống lúa trồng ven biển so với đối chứng sau khi nhuộm ethidium bromide trín gel agarose 5%, (b) của giống lúa Rạch Giâ vă Bông Hường so với giống chuẩn khâng mặn (Đốc Phụng) vă giống chuẩn nhiễm mặn (IR28) sau khi nhuộm bạc trín gel polyacrylamide 4%.. - Kết quả phđn tích điện di DNA của câc giống lúa, được phđn nhóm khả năng chống chịu mặn như bảng sau (Bảng 2).. - Bảng 2: Phđn nhóm khả năng chống chịu mặn của câc giống lúa trồng ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - TT Khả năng chống chịu mặn. - 3 Trung gian Đa dạng di truyền protein dự trữ. - Kết quả phđn tích protein dự trữ bằng phương phâp điện di SDS-PAGE ở Hình 2 cho thấy câc câ thể của hai giống Trắng Tĩp vă Lem Bụi (TV) có thể hiện câc dạng protein thănh phần như waxy, pro-glutelin57 kDa, α-Glutelin37-39 kD, β-Glutelin22-23 kDa, Globulin 26 kDa, Prolamin16 kDa, Prolamin13 kDa nhưng khâc nhau về mức độ đậm nhạt ở protein dạng α-vă β-Glutelin, prolamin13 kDa.. - Hình 2: Phổ điện di Protein dự trữ với 7 protein thănh phần trong hạt lúa Trắng Tĩp vă Lem Bụi (TV). - Kết quả phđn tích điện di protein dự trữ cho thấy ở giếng thứ 4 vă giếng thứ 8 của hai giống biểu hiện không có protein waxy lă Rạch Giâ vă Khao Dawk Mali (Hương) (Hình 3).. - Hình 3: Phổ điện di protein dự trữ của giống lúa Năng Quớt Biển, Rạch Giâ, Năng Níu, vă Khao Dak Mali (Hương). - Globulin lă protein tan trong dung dịch muối. - trong hạt gạo globulin được dự trữ chủ yếu ở lớp aleuron vă bị mất đi khi xay chă. - Kết quả phđn tích điện di cho thấy sự mất băng protein globulin hay không ăn mău phẩm nhuộm CBBR250 ở giếng thứ 5, 6 của giống Năng Châ vă giếng thứ 9, 10 của giống Năng Níu (Hình 4). - Kết quả phđn tích cho thấy: Protein dạng α-glutelin, β-glutelin, vă pro-glutelin đều hiện diện nhưng mức độ biểu hiện có khâc nhau, đđy lă vốn gen qủ, vì hai dạng protein thănh phần năy quyết định 80% protein nội nhũ (Ogawa et al, 1987) vă lă nguồn cung cấp. - không thể hiện băng Waxy. - thể hiện. - Hình 4: Phổ điện di protein thănh phần biẻu hiện tính đa dạng protein dạng Globulin của giống lúa Năng Châ vă Năng Níu. - Tóm lại, chính do sự biểu hiện ăn mău khâc nhau (không, nhạt, đậm) nhất lă sự mất băng hay đột biến lặn ở protein dự trữ biểu hiện ở câc protein waxy, globulin, prolamin 16 kDa, vă prolamin 13 kDa A đê phản ânh sự đa dạng protein dự trữ. - Chính nhờ sự đa dạng năy mă có thể tận dụng để cải tiến hăm lượng protein prolamin hoặc protein waxy (Kumamaru et al, 1986).. - Kết quả phđn tích về câc thông số đa dạng di truyền protein dự trữ cho thấy: giâ trị đa dạng di truyền kiểu hình (H o ) của câc giống được phđn tích có khoảng biến động từ 0,291 đến 2,688, thấp nhất lă giống Tăi Nguyín (LA), cao nhất lă giống Trắng Tĩp. - sự đa dạng di truyền kiểu gen (H EP. - câc giống phđn tích có giâ trị biến động trong khoảng từ 0,903 (giống Hai Bông) đến 0,940 (Thanh Tră). - *Độ đa dạng kiểu hình (H o. - giâ trị đa dạng di truyền kiểu hình protein dự trữ phụ thuộc văo tần số xuất hiện băng protein trong phổ điện di. - Kết quả cho thấy H 0 luôn >0, do vậy. - không thể hiện băng G l o b u l i n. - thể hiện băng Globulin. - tần suất xuất hiện kiểu hình protein dự trữ luôn <1, điều năy cho thấy kiểu hình protein dự trữ của câc giống phđn tích rất đa dạng với giâ trị lớn nhất lă 2,688, nhưng tập trung chủ yếu ở khoảng từ 1,0 – 1,9.. - Bảng 4: Đa dạng di truyền kiểu hình protein dự trữ của câc giống lúa trồng ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - Đa dạng di truyền kiểu gen (H EP. - có giâ trị trong khoảng từ 0 -1, H EP =0, giống thuần kiểu gen. - H EP có giâ trị căng tiến gần đến 1, giống căng có giâ trị đa dạng kiểu gen. - Kết quả phđn tích câc giống luôn có giâ trị H EP >0,9, điều năy phản ảnh không có giống năo đê thu thập ở trạng thâi thuần, vă giâ trị đa dạng cao nhất lă 0,94 ở giống Thanh Tră.. - Tổng số allele có hiệu quả ở mỗi locus (SENA): giâ trị năy phản ảnh số allele trung bình có tâc động kiểm soât protein dự trữ. - Kết quả phđn tích cho thấy đa số câc giống có số allele tập trung biến động trong khoảng từ 2,014 đến 3,058, điều năy cho thấy rằng câc giống quan sât biến thiín từ 2-3 allele trín mỗi locus tâc động kiểm soât sự hình thănh câc tính trạng protein dự trữ. - Qua kết quả trín cũng phản ânh câc giống có tính đa dạng về kiểu gen, giúp ưu thế chọn lọc có hiệu quả.. - Bảng 5: Phđn nhóm SENA của câc giống lúa trồng ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - Độ đa dạng di truyền kiểu gen của câc mẫu giống lúa đê phđn tích có tương quan rất chặt chẽ với tổng số allele có hiệu quả của mỗi locus (SENA) (r = 0,992. - (Hình 5) điều năy cho thấy rằng trong câc giống khảo sât có nhiều kiểu gen khâc nhau kiểm soât protein dự trữ.. - Hình 19 Tương quan giữa SENA vă H EP của 55 giống lúa trồng ven biển câc tỉnh Bến Tre, Long An, Tiền Giang, vă Tră Vinh năm 2001. - Hình 5: Tương quan giữa SENA vă H EP của câc giống lúa trồng ven biển vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - Trong câc giống lúa trồng trong vùng ven biển vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long có câc giống không chịu mặn, một số giống chịu mặn vă một văi giống trung gian. - Giâ trị đa dạng kiểu hình protein dự trữ khâ cao (H 0 >. - 1,86) phản ânh trong mỗi giống lúa mùa băng protein dự trữ có nhiều dạng hình khâc nhau, nín chọn lọc câ thể mong muốn trong mỗi giống sẽ có hiệu quả. - Giâ trị đa dạng kiểu gen protein rất cao (H EP >. - 0,9) phản ânh trong mỗi giống lúa mùa có nhiều kiểu gen qui định đến tính trạng protein dự trữ. - Tổng số allele có hiệu quả ở mỗi locus (SENA): đa số câc giống có số allele tập trung biến thiín từ 2-3 allele trín mỗi locus đóng góp văo sự đa dạng tính trạng protein dự trữ.. - Cần phục trâng câc giống lúa tẻ có khả năng chịu mặn, đạt tiíu chuẩn chất lượng thương phẩm vă chất lượng dinh dưỡng thuần hơn về mặt di truyền protein dự trữ như:Tăi Nguyín (LA), Năng Níu, Trắng Tĩp, Năng Thơm Chợ Đăo (TG2), Tăi Nguyín (LA).. - Tăi liệu tập huấn ứng dụng di truyền phđn tử trong công tâc chọn giống lúa