- KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA ĐẠM CỦA CHỦNG VI KHUẨN NITRATE HÓA CHỌN LỌC SỬ DỤNG CHO HỆ THỐNG LỌC TUẦN HOÀN TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN. - AOB, NOB, tôm thẻ chân trắng, vi khuẩn nitrate hóa Keywords:. - Treatment 1: added bacteria AOB TB7.2;. - Treatment 2: added NOB TV4.2 and Treatment 3: added a mixture of bacteria AOB TB7.2 and NOB TV4.2. - The results showed that the addition of bacteria AOB TB7.2 and NOB TV4.2 to the biofilter of circulatory system reduced the concentration of toxic gases such as ammonia and nitrite in the culture tank, and significantly increased shrimp survival. - Adding a combination of AOB TB7.2 and NOB TV4.2, the nitrification process took place faster than single supplementation. - Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá khả năng chuyển hóa đạm của các chủng vi khuẩn nitrate hóa chọn lọc từ ao nuôi tôm sử dụng cho hệ thống lọc tuần hoàn trong nuôi tôm thẻ trên bể. - Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. - Đối chứng: không bổ sung vi khuẩn. - 2) Nghiệm thức 1: bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2. - Nghiệm thức 2: bổ sung vi khuẩn NOB TV4.2 và Nghiệm thức 3: bổ sung hỗn hợp vi khuẩn AOB TB7.2 và NOB TV4.2. - Kết quả cho thấy việc bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 và vi khuẩn NOB TV4.2 vào bể lọc sinh học trong hệ thống tuần hoàn làm giảm hàm lượng các khí độc ammonia và nitrite trong bể nuôi, tăng tỉ lệ sống, khác biệt có ý nghĩa thống kê đồng thời tái sử dụng được nguồn nước trong suốt chu kỳ nuôi, giảm thiểu tác động đến môi trường bên ngoài. - Bổ sung kết hợp AOB TB7.2 và NOB TV4.2 quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh hơn so với bổ sung đơn dòng. - Quá trình nitrite hóa và nitrate hóa diễn ra sớm hơn ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn so với đối chứng (nitrite hóa và nitrate hóa là 7 ngày và 14 ngày. - 14 ngày và 35 ngày lần lượt ở nghiệm thức bổ sung vi khuẩn và đối chứng).. - Trong nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rất phổ biến để xử lý nước trong lĩnh vực sản xuất giống thủy sản và nuôi thâm canh.. - Ở các bể lọc sinh học, vi khuẩn oxy hóa amonia (Nitrosomonas) sẽ chuyển hóa NH 3 thành NO 2 , kế đến vi khuẩn oxy hoá nitrite (Nitrobacter) chuyển hóa NO 2 - thành NO 3. - Các vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa là vi khuẩn hóa vô cơ tự dưỡng, các loài vi khuẩn nitrate hóa thường gặp là Nitrosomonas europaea, Nitrobacter vinogradskii, Nitrobacte ragilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis (Stephen et al., 1996).. - Quy trình sản xuất có thể dựa hoàn toàn vào nhóm vi sinh vật chuyển hóa đạm tự nhiên (vi khuẩn nội sinh), tuy nhiên để quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh chóng và hiệu quả, việc chủ động bổ sung nhóm vi khuẩn này vào hệ thống lọc tuần hoàn sẽ giảm thời gian khởi động của bể lọc tuần hoàn từ 3 tuần xuống 1 tuần (Gromen et al., 2002). - Ở nước ta, chế phẩm sinh học được sử dụng rất phổ biến chủ yếu là vi khuẩn nhóm phân huỷ các chất hữu cơ (Bacillus), trong khi đó chế phẩm vi sinh có thành phần là vi khuẩn nitrate hóa còn rất hạn chế (Vũ Thế Trụ, 2012). - Vì vậy việc nghiên cứu khảo sát khả năng chuyển hóa đạm của chủng vi khuẩn nitrate hóa chọn lọc từ ao nuôi tôm sử dụng cho hệ thống lọc tuần hoàn là rất cần thiết nhằm tuyển chọn các chủng vi khuẩn chuyển hoá đạm hiệu quả làm chế phẩm vi sinh phục vụ nuôi trồng thủy sản.. - Đối tượng thí nghiệm. - Các chủng vi khuẩn oxy hóa ammonia (AOB) TB7.2 và oxy hóa nitrite (NOB) TV4.2 được chọn để bố trí thí nghiệm có nguồn gốc phân lập từ mẫu bùn ao nuôi tôm và bảo quản tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật hữu ích, Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.. - trong bể 5 m 3 ở nhiệt độ 28-29°C khoảng 2 tuần trước khi bố trí thí nghiệm. - Phương pháp chuẩn bị vi khuẩn Vi khuẩn AOB TB7.2 và NOB TV4.2 được phục hồi và nuôi tăng sinh lần lượt trong môi trường khoáng cơ bản (gồm 0,1 g MgSO 4 .7H 2 O. - 15 g NaCl và 1000 mL nước cất) bổ sung 0,5 g/L (NH 4 ) 2 SO 4 đối với vi khuẩn AOB và 0,5 g/L NaNO 2 với vi khuẩn NOB (Spieck &. - Vi khuẩn được nuôi trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong điều kiện che tối ở 28°C. - Sau 7 ngày nuôi, sinh khối tế bào được thu và pha loãng với nước muối sinh lý sau khi ly tâm ở tốc độ 3.500 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, sau đó điều chỉnh dung dịch huyền phù vi khuẩn với môi trường tương ứng để đạt giá trị mật độ quang OD ở bước sóng 600 nm (tương ứng với mật độ vi khuẩn 10 6 CFU/mL) và kiểm tra lại bằng phương pháp trải đĩa thạch trên môi trường khoáng cơ bản tương ứng cho vi khuẩn AOB và NOB (Karthik et al., 2015).. - Bố trí thí nghiệm. - Thí nghiệm được bố trí trên hệ thống tuần hoàn gồm 3 bể nuôi 500 L, bể lắng cơ học 500 L và bể lọc sinh học 500 L. - Thí nghiệm được thiết kế gồm bốn hệ thống tuần hoàn riêng biệt tương ứng với từng nghiệm thức:. - Đối chứng: không bổ sung vi khuẩn.. - Nghiệm thức 1: bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 Nghiệm thức 2: bổ sung vi khuẩn NOB TV4.2. - Nghiệm thức 3: bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 và NOB TV4.2. - Mỗi nghiệm thức bố trí lặp lại ba lần và theo dõi trong 63 ngày nuôi. - Vi khuẩn được cấy vào bể chứa giá thể sinh học theo từng nghiệm thức (để đạt mật số 10 5 CFU/mL) trước khi bố trí tôm 1 ngày và bổ sung vi khuẩn định kỳ 2 tuần/lần trong suốt quá trình nuôi (Suantika et al., 2017).. - Tăng trưởng của tôm: khối lượng của tôm được xác định sau 63 ngày thí nghiệm. - được chuyển về arcsine trước khi xử lý ANOVA và phân tích so sánh thống kê giữa nghiệm thức đối chứng và bổ sung vi khuẩn ở mức tin cậy 95% bằng phần mềm SPSS 20.0.. - Trong suốt quá trình thí nghiệm, nhiệt độ ghi nhận ở các bể nằm trong khoảng thích hợp cho tôm nuôi và ít có biến động giữa các nghiệm thức (từ C). - Giá trị pH trong quá trình thí nghiệm cũng ít có sự dao động và duy trì trong khoảng ở các nghiệm thức. - Whetstone et al., 2002) và trong ngưỡng 7,2-8,2 được xem là phù hợp cho sự phát triển của vi khuẩn nitrate hóa (Alleman, 1984). - Như vậy, các thông số nhiệt độ và pH trong thời gian thí nghiệm đều nằm trong ngưỡng tối ưu cho tôm thẻ chân trắng sinh trưởng tốt.. - Chỉ tiêu độ mặn, hàm lượng oxy hòa tan và tổng kiềm trong thí nghiệm. - Thông số Đối chứng AOB TB7.2 NOB TV4.2 AOB TB7.2 và NOB TV4.2. - Bảng 1 cho thấy độ mặn trong các nghiệm thức luôn duy trì ở mức 14,7±0,5‰ và khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các bể (p>0,05). - Hàm lượng oxy hòa tan giữa các nghiệm thức dao động trong khoảng 4,39-4,74 mg/L, đây được xem là khoảng thích hợp cho sự sinh trưởng của tôm. - Bên cạnh đó, độ kiềm ghi nhận giữa các bể dao động khoảng 81-126 mg CaCO 3 /L trong suốt quá trình thí nghiệm. - trong nước diễn ra bởi nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Ebeling et al., 2006) và độ kiềm thiếu hụt do nguồn nước cấp vào. - Do đó, độ kiềm trong thí nghiệm hiện tại luôn được tối ưu bằng việc bổ sung Sodium bicarbonate (NaHCO 3 , Ấn Độ).. - Hàm lượng tổng đạm ammonia (TAN) Kết quả theo dõi cho thấy hàm lượng TAN (Hình 1) trong hệ thống tuần hoàn có xu hướng tăng nhanh trong 14 ngày nuôi, đạt giá trị cao nhất mg/L) ở nghiệm thức đối chứng, trong khi nghiệm thức bổ sung đơn dòng AOB TB7.2, NOB TV4.2 và bổ sung kết hợp AOB TB7.2 với NOB TV4.2 đạt. - Kết quả này cho thấy bổ sung vi khuẩn Nitrosomonas giúp giảm hàm lượng TAN thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với hai nhóm nghiệm thức còn lại.. - Tuy nhiên, sau 14 ngày nuôi hàm lượng TAN ở nghiệm thức đối chứng và bổ sung đơn dòng NOB TV4.2 có xu hướng giảm đáng kể. - Điều này cho thấy quần thể vi khuẩn oxi hóa ammonia xuất hiện và hoạt động mạnh sau 2 tuần thí nghiệm. - Vào cuối giai đoạn thí nghiệm, từ ngày 28 trở đi, TAN ở các nghiệm thức biến động trong khoảng mg/L và không có khác biệt ở các nghiệm thức (p>0,05. - Nguyên nhân có thể là do sự phát triển của hệ vi khuẩn nội sinh trong giá thể sinh học đã chuyển hóa ammonia thành nitrite ở nghiệm thức đối chứng. - Tương tự trong một báo cáo trước đây, quần thể vi khuẩn oxy hóa ammonia hình thành trong bể ương tôm thẻ chân trắng và chuyển hóa ammonia thành nitrite sau 5 tuần thí nghiệm (Correia et al., 2014) và chu kỳ xuất hiện nhóm quần thể vi khuẩn này phụ thuộc vào các yếu tố môi trường (Ferreira et al., 2015). - Do đó, việc bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 vào hệ thống nuôi đã thúc đẩy quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh hơn so với hệ thống không bổ sung. - Biến động hàm lượng TAN trong thí nghiệm. - Hàm lượng nitrite (N-NO 2. - Dữ liệu ghi nhận được hàm lượng N-NO 2 - ở nghiệm thức đối chứng có chiều hướng tăng nhanh, cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn (p<0,05), đạt giá trị cao nhất mg/L sau 35 ngày nuôi, sau đó giảm dần về cuối giai đoạn thí nghiệm và không khác biệt so với nhóm nghiệm thức còn lại (p>0,05. - Hàm lượng N-NO 2 - ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn đơn dòng và kết hợp cũng tăng nhanh trong 28 ngày đầu thí nghiệm, trong đó nghiệm thức bổ sung đơn dòng AOB TB7.2 đạt giá trị trung bình mg/L thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với các nhóm nghiệm thức còn. - Vào cuối giai đoạn thí nghiệm, hàm lượng N- NO 2 - ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn có chiều hướng giảm dần và giá trị thấp nhất ghi nhận ở nghiệm thức bổ sung đơn dòng AOB TB mg/L). - (2014), nhóm vi khuẩn oxi hóa nitrite phát triển chậm trong môi trường, do đó hàm vi khuẩn lượng N-NO 2 - tăng liên tục đến ngày nuôi thứ 35 và sau đó quá trình chuyển hóa nitrite thành nitrate diễn ra mạnh. - Kết quả ghi nhận cho thấy hàm lượng N-NO 2 - ở các nghiệm thức bổ sung AOB TB7.2 và NOB TV4.2 nằm trong ngưỡng an toàn cho tôm phát triển.. - Biến động hàm lượng N-NO 2 - trong thí nghiệm. - Biến động hàm lượng nitrate (N-NO 3. - Kết quả ghi nhận hàm lượng N-NO 3 - của các nghiệm thức có xu hướng tăng theo thời gian nuôi (Hình 3). - Trong 21 ngày đầu của thí nghiệm, hàm lượng N-NO 3 - ghi nhận ở các bể dao động trong khoảng mg/L, trong đó nhóm nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức bổ sung vi khuẩn NOB TV4.2 thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với hai nhóm nghiệm thức bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 còn lại. - Tuy nhiên, vào ngày nuôi thứ 21 kết quả ghi nhận không có sự khác biệt thống kê (p>0,05) giữa các nghiệm thức trước khi tăng nhanh vào cuối giai đoạn thí nghiệm. - Cụ thể là hàm lượng N-NO 3 - sau 63 ngày theo dõi ở nghiệm thức đối chứng đạt nồng độ mg/L, thấp. - hơn và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nhóm nghiệm thức bổ sung vi khuẩn, trong khi đó hàm lượng N-NO 3 - ở nghiệm thức bổ sung kết hợp AOB TB7.2 và NOB TV4.2 đạt giá trị cao nhất mg/L). - Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhóm vi khuẩn AOB TB7.2 và NOB TV4.2 đã thúc đẩy quá trình nitrate hóa dẫn đến làm gia tăng hàm lượng N-NO 3 - vào cuối giai đoạn thí nghiệm. - (2014) cho thấy quá trình chuyển hóa nitrite thành nitrate trong bể tôm nuôi diễn ra sau 5 tuần thí nghiệm và hàm lượng N-NO 3 - đạt giá trị trung bình 95 mg/L, tuy nhiên không ảnh hưởng đến sinh trưởng của tôm.. - Hàm lượng này cao hơn so với kết quả ghi nhận được trong nghiên cứu.. - AOB TB7.2 NOB TV4.2 AOB TB7.2 và NOB TV4.2. - Biến động hàm lượng N-NO 3 - trong thí nghiệm. - do hoạt động của nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia (ammonia-oxidizing bacteria, AOB) và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (nitrite-oxidizing bacteria, NOB). - Nitrosomonas đại diện cho nhóm vi khuẩn AOB tham gia phản ứng chuyển hóa NH 3 /NH 4. - Trong thí nghiệm hiện tại, việc bổ sung các chủng vi khuẩn AOB TB7.2 và NOB TV4.2 đã gia tăng hiệu suất chuyển hóa đạm trong hệ thống, đặc biệt là ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn AOB TB7.1. - Vào giai đoạn đầu của thí nghiệm, nồng độ TAN tích tụ được coi là nguồn năng lượng chuyển hóa cho quá trình sinh tổng hợp của nhóm vi khuẩn AOB. - được biết là sản phẩm trung gian của quá trình nitrate hóa và cũng là yếu tố giới hạn lên sự phát triển của nhóm vi khuẩn NOB. - Điều này thấy rõ khi vào giữa chu kỳ thí nghiệm, sự hiện diện của nồng độ NO 2 - cao đã kích thích quá trình đồng hóa diễn ra ở vi khuẩn NOB nội sinh và vi khuẩn NOB TV4.2 tạo ra sản phẩm cuối là nitrate (NO 3. - Vì vậy ở các nghiệm thức được bổ sung dòng vi khuẩn AOB TB7.1 vào đầu giai đoạn thí nghiệm cho hiệu quả xử lý nước trong hệ thống tốt hơn.. - Các chỉ tiêu tăng trưởng của tôm sau 63 ngày thí nghiệm. - Chỉ tiêu Nghiệm thức. - Đối chứng AOB TB7.2 NOB TV4.2 AOB TB7.2 và NOB TV4.2 Khối lượng tôm bố trí (g) 0,47±0,1 a 0,47±0,1 a 0,47±0,1 a 0,47±0,1 a Khối lượng tôm thu (g a 5,69±0,27 a 5,68±0,13 a 5,81±0,09 a DWG (g/ngày a a a a. - Các giá trị trung bình trên cùng một hàng có chữ cái giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) Khối lượng tôm kết thúc thí nghiệm đạt giá trị. - trung bình 5,69±0,09 g và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (p>0,05). - trưởng tương đối (SGR) ở nghiệm thức bổ sung kết hợp AOB TB7.2 và NOB TV4.2 đạt giá trị cao nhất lần lượt là g/ngày và ngày, cũng không có sự sai khác về mặt. - AOB TB7.2 NOB TV4.2. - AOB TB7.2 và NOB TV4.2. - Điều này cho thấy việc bổ sung vi khuẩn nitrate hóa không ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng trưởng của tôm. - Tuy nhiên, tỉ lệ sống của tôm ở nghiệm thức đối chứng đạt thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nhóm nghiệm thức bổ sung khuẩn, trong đó nghiệm thức bổ sung AOB TB7.2 và bổ sung kết hợp với NOB TV4.2 đạt tỉ lệ sống cao nhất, lần lượt và 97±0,01%. - Kết quả nghiên cứu hiện tại tương tự với một nghiên cứu trước, việc bổ sung giá thể chứa vi khuẩn nitrate hóa vào bể tôm nuôi đạt tỉ lệ sống (72,44%) và tốc độ tăng trưởng tương đối (12,86%) cao hơn và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nhóm không bổ sung (Maya et al., 2013). - Qua đó, việc bổ sung vi khuẩn nitrate hóa vào bể nuôi góp phần cải thiện tỉ lệ sống, giảm các chất gây độc (NH 3 , NO 2. - Việc bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 và vi khuẩn NOB TV4.2 vào bể lọc sinh học trong hệ thống tuần hoàn làm giảm hàm lượng các khí độc ammonia và nitrite trong bể nuôi, tăng tỉ lệ sống và tái sử dụng được nguồn nước trong suốt chu kỳ nuôi, giảm thiểu tác động đến môi trường bên ngoài.. - Bổ sung đơn dòng AOB TB7.2 và bổ sung kết hợp AOB TB7.2 với NOB TV4.2 thúc đẩy quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh hơn so với bổ sung đơn dòng NOB TV4.2. - Đặc biệt là quá trình nitrite hóa ở các nghiệm thức được bổ sung vi khuẩn AOB TB7.2 diễn ra trong 7 ngày, nhanh hơn so với nghiệm thức đối chứng là 14 ngày. - Bên cạnh đó, quá trình nitrate hóa ở các nghiệm thức bổ sung khuẩn thể hiện rõ rệt sau 28 ngày thí nghiệm, trong khi ở nghiệm thức đối chứng là 35 ngày.. - Từ kết quả nghiên cứu trên, cần tiến hành các thí nghiệm đánh giá sự đa dạng của quần thể vi khuẩn trong hệ thống bể lọc sinh học bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing – NGS) nhằm xác định sự phong phú và đa dạng của nhóm loài vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường từ đó làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu trên.