- KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ TẾ BÀO MIN6 TỤY TẠNG CỦA DỊCH TRÍCH METHANOL LÁ XOÀI NON (Mangifera indica L.). - Bệnh đái tháo đường, kháng oxy hóa, lá xoài non, Mangifera indica L., stress mạng nội chất, tế bào MIN6 Keywords:. - Khả năng bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi sự phá hủy bởi stress mạng nội chất của dịch trích lá xoài non (Mangifera indica L.) được thực hiện in vitro trên tế bào MIN6. - Sự chết của tế bào MIN6 được gây ra do tunicamycin ở nồng độ 5 µg/mL, sau 24 giờ ủ ở điều kiện 37 o C và 5% CO 2 . - Khả năng gây độc đối với tế bào MIN6 của dịch trích lá xoài non (LXN) được khảo sát ở nồng độ từ 50 đến 500 µg/mL ở điều kiện ủ 37 o C và 5% CO 2 trong 48 giờ. - Khả năng bảo vệ tế bào MIN6 của dịch trích LXN cũng được khảo sát. - Kết quả khảo sát cho thấy, ở các nồng độ khảo sát LXN không gây độc tế bào MIN6 trong 48 giờ. - Nồng độ dịch trích LXN có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất tốt nhất là 500 µg/mL. - Bên cạnh đó, thí nghiệm đã chứng minh dịch trích LXN có hiệu quả kháng oxy hóa. - Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), khử sắt (RP) và 2, 2'-azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS. - Kết quả chứng minh, LXN có tiềm năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường theo cơ chế kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào β của tụy tạng khỏi sự chết bởi stress mạng nội chất.. - Khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng của dịch trích methanol lá xoài non (Mangifera indica L. - Nguyên nhân gây ra bệnh đái tháo đường type 2 là do sự kháng insulin ở cơ quan đích (gan, cơ vân, mô mỡ) kèm theo suy giảm chức năng tế bào β tụy.. - Ngoài ra, mangiferin còn có tác dụng bảo vệ tế bào gan, kháng viêm ở chuột với liều lượng từ 15-30 mg/kg trọng lượng. - Vì vậy, trong nghiên cứu này LXN được nghiên cứu khả năng điều trị BĐTĐ thông qua giá khả năng kháng oxy hóa, kháng stress mạng nội chất ở tế bào tụy tạng.. - 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tunicamycin (Sigma, Nhật Bản) được sử dụng là chất gây chết tế bào MIN6 thông qua cơ chế ức chế N-acetylglucosamine-1-phosphate transferase, ngăn cản quá trình tổng hợp glycoprotein ở những giai đoạn đầu. - chất gây stress mạng nội chất trong thời gian dài dẫn đến tình trạng chết tế bào (Rojas et al., 2014).. - Trong nghiên cứu này, tế bào tụy tạng dòng MIN6 được cung cấp bởi viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản. - Tế bào tụy tạng MIN6 được nuôi trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium), 25 mM glucose, 15% FCS (fetal calf serum), 1% natri pyruvat, 83 μM β-mercaptoethanol trong tủ ủ đảm bảo điều kiện 37 o C và 5% CO 2 trong suốt thời gian thử nghiệm.. - Tế bào MIN6 là dòng tế bào kết dính. - Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy, bề mặt dĩa plastic đóng vai trò là giá thể để tế bào MIN6 bám vào. - Sau 2-3 ngày, tỷ lệ diện tích huyền phù tế bào/ thể tích bề mặt đĩa nuôi cấy tăng khoảng ≥ 85% so với thời điểm ban đầu (Lee et al., 2014). - Khi đó, tế bào được tiến hành cấy chuyển sang môi trường mới. - Dòng tế bào MIN6 mang những điểm thuận lợi cho việc ứng dụng nghiên cứu BĐTĐ vì đây là nơi tổng hợp enzyme glucokinase và protein vận chuyển Glut2 (glucose transporter 2). - Protein vận chuyển Glut2 đóng vai trò vận chuyển glucose từ máu qua màng tế bào. - Vì vậy, khi tế bào tụy tạng MIN6 bị phá hủy sẽ dẫn đến tình trạng tập trung quá mức lượng glucose huyết trong máu và dẫn đến tình trạng tăng glucose huyết. - (2010), dòng tế bào MIN6 cũng được chứng minh là dòng tế bào tốt nhất để nghiên cứu bệnh đái tháo đường (Skelin et al., 2010).. - 2.3 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của dịch trích LXN. - 2.3.1 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-. - Dịch trích LXN được pha loãng trong methanol theo dãy nồng độ từ và 90 µg/mL. - Trolox (0-3 mM) được sử dụng như chất kháng oxy hóa chuẩn. - 2.3.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt. - Khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt được thực hiện theo phương pháp của. - Andrea et al. - 2.3.3 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc ABTS+. - Hoạt tính kháng oxy hóa của. - 2.4 Khảo sát khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khỏi quá trình chết của dịch trích LXN. - Khảo sát khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khỏi quá trình chết của dịch trích LXN được tiến hành bằng cách nuôi tế bào trong môi trường DMEM.. - Tế bào MIN6 (10 4 tế bào/mL) được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung tunicamycin (5 μg/mL) (Rojas et al., 2014) trong điều kiện có dịch trích LXN ở các nồng độ khảo sát và 500 µg/mL hoặc không có bổ sung dịch trích LXN ở thời điểm khảo sát 24 và 48 giờ. - Ảnh hưởng của dịch trích LXN đến sự sống của tế bào cũng được thực hiện tương tự bằng cách nuôi tế bào trong môi trường DMEM có bổ sung dịch trích ở các nồng độ từ 50 đến 500 µg/mL. - Sau 2 giờ, tế bào được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng λ = 450 nm. - Những tế bào còn sống sẽ tiết ra enzyme dehydrogenase chuyển một phân tử hidro từ NADPH kết hợp với dung dịch WST_8, làm thay đổi màu của dung dịch WST_8 từ vàng nhạt sang màu cam (Lee et al., 2014, Liu et al., 2016).. - 3.2 Hiệu quả kháng oxy hóa của dịch trích LXN 3.2.1 Hiệu quả kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH. - Nồng độ dịch trích. - Hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương Trolox (µg/mL). - Hàm lượng chất kháng oxy hóa và khả năng kháng oxy hóa tăng tỷ lệ thuận với nồng độ dịch trích. - Khi tăng nồng độ dịch trích từ 30-90 µg/mL thì khả năng kháng oxy hóa của LXN tăng từ đến . - Kết quả này cho thấy, khả năng kháng oxy hóa của LXN (EC 50. - 3.2.2 Hiệu quả kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt của dịch trích LXN. - Hàm lượng chất kháng oxy hóa có trong dịch trích LXN được tính tương đương với Butylated hydroxyanisole (BHA ) d ựa vào đường chuẩn y = 0,012x + 0,143 (R² = 0,9926). - Kết quả cho thấy, nồng độ dịch trích tăng từ 100 µg/mL đến 500 µg/mL thì hàm lượng chất kháng oxy hóa tăng dần tương ứng từ đến µg/mL (Bảng 3). - Kết quả này cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa tỷ lệ thuận với nồng độ dịch trích. - (2016), đã chứng minh dịch trích LXN có hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn.. - Bảng 3: Hàm lượng chất kháng oxy hóa tính tương đương µg/mL BHA và hiệu suất khử sắt của dịch trích LXN. - Nồng độ dịch trích (µg/mL). - Hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương BHA (µg/mL). - Hiệu quả kháng oxy hóa của dịch trích LXN ở các nồng độ khác nhau khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,5). - Kết quả này cho thấy rằng hiệu quả kháng oxy hóa của dịch trích LXN (EC µg/mL) thấp hơn khả năng kháng oxy hóa của BHA (EC 50 = 30,1 µg/mL) là 10,3 lần. - 3.2.3 Hiệu quả kháng oxy hóa bằng phương pháp ABTS. - Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng dịch trích LXN có khả năng trung hòa gốc tự do ABTS. - Hiệu suất hấp thu gốc tự do của LXN tăng tỷ lệ thuận với nồng độ dịch trích. - Bảng 4: Hàm lượng chất kháng oxy hóa tính tương đương µg/mL Trolox và hiệu suất trung hòa gốc tự do ABTS + của dịch trích LXN. - Ức chế sự hình thành các gốc tự do sẽ giảm sự ảnh hưởng của các phân tử hữu cơ và vô cơ gây tổn hại đến tế bào. - Nghiên cứu này đã chứng minh LXN có khả năng kháng oxy hóa. - 3.2.4 Hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 khỏi quá trình chết do tunicamycin gây ra của LXN. - Trong thí nghiệm này, tế bào MIN6 được gây chết bằng tunicamycin và khảo sát khả năng bảo vệ tế bào MIN6 tránh khỏi sự chết này bằng dịch trích methanol LXN. - Tuy nhiên, để khẳng định cơ sở khoa học về độ an toàn của LXN với tế bào MIN6 tụy tạng, dịch trích đã được khảo sát khả năng gây độc trên tế bào MIN6 trong 48 giờ ở nồng độ từ 50 đến 500 µg/mL trong điều kiện ủ 37 o C và 5% CO 2 . - Kết quả về tỷ lệ tế bào sống của tế bào MIN6 khi ủ với dịch trích LXN sau 48 giờ được trình bày trong Bảng 5.. - Vì vậy, LXN được kết luận là không gây độc cho tế bào MIN6 sau 48 giờ ủ ở các nồng độ khảo sát từ 50 đến 500 μg/mL. - Từ đó có thể kết luận rằng, dịch trích LXN không là nguyên nhân gây chết tế bào MIN6 tụy tạng. - Bảng 5: Ảnh hưởng của dịch trích LXN đến sự phát triển của tế bào MIN6 tụy tạng Nồng độ dịch trích. - (µg/ mL) Tỷ lệ tế bào sống. - Sau khi chứng minh dịch trích LXN không gây độc cho tế bào MIN6, thí nghiệm khảo sát khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khỏi sự chết được thực hiện. - Trong thí nghiệm này, nồng độ của tunicamycin được sử dụng để gây chết tế bào MIN6 là 5 μg/mL trong thời gian từ 24 đến 48 giờ (Oslowski and Urano, 2011, Puyal et al., 2013).. - Ở mức thời gian 24 giờ, khả năng bảo vệ tế bào MIN6 khỏi stress mạng nội chất dẫn đến sự chết của LXN (ở các nồng độ từ 50-500 µg/mL) được khảo sát khi ủ tế bào MIN6 với tunicamycin ở nồng độ 5 µg/mL. - Kết quả thí nghiệm được trình bày ở Hình 1 cho thấy, khi tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường có tunicamycin và dịch trích LXN trong thời gian 24 giờ thì tỷ lệ sống của tế bào cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức tế bào chỉ được nuôi trong môi trường có tunicamycin P<0,05). - Tỷ lệ sống của tế bào MIN6 ở các nghiệm thức tăng tỷ lệ thuận với nồng độ LXN khảo sát, ở nồng độ 50 µg/mL tỷ lệ sống của tế bào MIN6 là . - tỷ lệ sống của tế bào đạt ở nồng độ dịch trích LXN 500 µg/mL.. - Ở mức thời gian 48 giờ, khi tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường có tunicamycin nồng độ 5 µg/mL, tỷ lệ sống của tế bào chỉ còn . - Nhưng khi tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường có tunicamycin nồng độ 5 µg/mL có bổ sung thêm dịch trích LXN ở các nồng độ và 500 µg/mL thì tỷ lệ sống của tế bào MIN6 ở các nghiệm thức lần lượt tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức chỉ nuôi trong môi trường có tunicamycin lần lượt là:. - K hi xét ở cùng thời điểm khảo sát 48 giờ, kết quả cho thấy tỷ lệ sống của tế bào ở nồng độ LXN 500 µg/mL cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nồng độ. - Từ kết quả này, ở nồng độ 500 µg/mL, LXN đạt hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6 khỏi tổn thương stress mạng nội chất tốt nhất.. - Những kết quả trên cho thấy rằng LXN ở các nồng độ khảo sát có khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng MIN6 khỏi quá trình chết do stress mạng nội chất. - Ở nồng độ 500 µg/mL, dịch trích LXN có khả năng bảo vệ tế bào MIN6 tốt nhất. - Tỷ lệ tế bào. - Dịch trích trái dâu tằm đã được chứng minh có khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng MIN6 khỏi sự chết là 1,33 lần so với nghiệm thức đối chứng (Lee et al., 2014). - Khảo sát này đã chứng minh được khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng MIN6 của LXN cao hơn so với dịch trích trái dâu tằm.. - Hình 1: Khả năng bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng khỏi quá trình chết của LXN Ghi chú: DMEM: tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường DMEM. - Tm: tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung Tm (µg/mL), từ 50-500: Tế bào MIN6 được nuôi trong môi trường DEME bổ sung Tm (5 µg/mL) và dịch trích LXN ở các nồng độ từ 50-500 µg/mL. - khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% khi so sánh giữa thời gian khảo sát 24 giờ và 48 giờ ở cùng nồng độ dịch trích LXN. - Các tế bào trong cơ thể có khả năng tự điều chỉnh để thích nghi với chức năng của nó và tự bảo vệ trước các tác nhân gây tổn thương. - Tế bào có khuynh hướng duy trì các thông số sinh lý nội môi.. - Khi rơi vào trạng thái stress sinh lý hay stress do nhân tố kích thích bệnh lý, tế bào có thể thích nghi để duy trì sự sống hoặc chết. - Stress oxy hóa được chứng minh là nguyên nhân dẫn đến sự tổn thương và chết của tế bào tụy tạng gây ra BĐTĐ type 2 và có mối quan hệ chặt chẽ với bệnh béo phì (Zhao et al., 2006). - Vì vậy, thực vật có khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng khỏi stress mạng nội chất đóng vai trò quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn dược liệu điều trị BĐTĐ. - Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng, dịch trích LXN không gây độc tính cho tế bào MIN6 tụy tạng. - Bên cạnh đó, dịch trích LXN được khẳng định có khả năng bảo vệ tế bào tụy tạng khỏi sự chết do stress mạng nội chất gây ra bởi tunicamycin. - LXN cũng được chứng minh có khả năng kháng oxy hóa. - Kaeko Kamei, Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản đã cung cấp dòng tế bào MIN6 và các hóa chất, phương tiện để thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy tế bào.. - Tỷ lệ tế bào sống