- KHẢ NĂNG KÍCH KHÁNG LƯU DẪN CỦA VI KHUẨN Bacillus SPP.. - Bacillus, bệnh cháy lá, cây lúa, kích kháng lưu dẫn Keywords:. - Nghiên cứu được thực hiện tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ nhằm đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh cháy lá lúa của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp. - amyloliquefaciens là tác nhân kích kháng lưu dẫn triển vọng đối với bệnh cháy lá lúa, giúp cây lúa có mức độ nhiễm bệnh thấp hơn so với đối chứng không xử lý, với hiệu quả giảm bệnh khoảng 90%. - amyloliquefaciens có sự gia tăng hoạt tính β-1,3- glucanase và chitinase, tương ứng theo thứ tự về hiệu quả giảm bệnh. - Sự gia tăng hoạt tính của các enzyme này có thể liên quan tới khả năng kích kháng lưu dẫn của vi khuẩn Bacillus đối với bệnh cháy lá lúa.. - Khả năng kích kháng lưu dẫn của vi khuẩn Bacillus spp. - có khả năng kích kháng tốt trên lúa đối với bệnh cháy lá và khảo sát cơ chế có liên quan.. - Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 lần lặp lại, gồm 13 nghiệm thức (1 chủng vi khuẩn Bacillus spp., đối chứng dương BIOSAR- 3 ĐHCT (hoạt chất chính là CuCl 2 .2H 2 O, xử lý ở nồng độ 0,05mM) (Phạm Văn Kim và ctv., 2004) và đối chứng âm (chủng bệnh và không chủng bệnh, để so sánh hoạt tính enzyme).. - Xử lý kích kháng bằng cách ngâm hạt trong 24 giờ với huyền phù (mật số 10 8 cfu/ml) của từng chủng vi khuẩn, sau đó ủ tiếp 36 giờ, xử lý lần hai bằng cách phun lá vào 16 NSKG (có lá 4) (Kloepper et al., 2004, De Vleesschauwer et al., 2008). - Hạt của nghiệm thức đối chứng được ngâm, ủ với nước cất.. - Thu thập mẫu lá lúa cho phân tích hoạt tính các enzyme vào các thời điểm ngày sau khi lây nhiễm bệnh. - Ngay sau khi thu, mẫu được xử lý với nitơ lỏng, bảo quản ở -20 o C. - Hoạt tính của β-1,3- glucanase được xác định dựa theo Isaac and Gokhale (1982), thời gian phản ứng giữa 0,05 ml dịch trích enzyme (khoảng 25 µg protein) với chất nền (0,05% laminarin trong dung dịch 0,05M Na-acetate, pH 5,2) là 15 phút, ở 37 o C.. - Dựa vào đường chuẩn glucose tiến hành xác định lượng glucose được phóng thích, hoạt tính β-1,3- glucanase được thể hiện bằng số đơn vị μM glucose min -1 mg -1 protein (1 đơn vị = μM glucose min -1 mg -1 protein).. - Hoạt tính của chitinase được xác định dựa theo Kobayashi et al. - Hoạt tính chitinase được thể hiện bằng số đơn vị μM N-acetyl-glucosamine giờ -1 mg -1 protein (1 đơn vị = μM N-acetyl glucosamine giờ -1 mg -1 protein).. - 3.1 Đánh giá khả năng kích kháng thông qua biểu hiện của bệnh cháy lá lúa. - -P47, -P77, -P78, -P81, -P84 có khả năng kích kháng tốt được khảo sát lần hai.. - Ở 3 NSKC, các nghiệm thức có xử lý đều có TLDTLNB thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng âm (0,79. - Trong đó, các nghiệm thức được xử lý với các vi khuẩn Bacillus-P77. - amyloliquefaciens có TLDTLNB thấp hơn các chủng vi khuẩn khác và tương đương với đối chứng dương CuCl 2 (0,06%).. - Ở các thời điểm 5 và 7 NSKC, hầu hết các nghiệm thức đều có TLDTLNB tăng lên nhưng các nghiệm thức được xử lý với vi khuẩn Bacillus vẫn có TLDTLNB thấp hơn so với đối chứng âm (1,39. - P84 và Bacillus amyloliqueciens tiếp tục có TLDTLNB thấp và tương đương với đối chứng dương CuCl . - của các nghiệm thức qua các thời điểm. - Nghiệm thức Tỷ lệ diện tích lá nhiễm bệnh. - Đối chứng. - Hình 1: Vết bệnh ở 10 NSKC ở các nghiệm thức có biểu hiện kích kháng so với đối chứng âm Ghi chú: các nghiệm thức có xử lý kích kháng: A. - Đối Chứng âm. - Đến thời điểm 10 NSKC, các nghiệm thức vẫn duy trì được hiệu quả kích kháng, với TLDTLNB thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm (6,08. - Trong đó, ba nghiệm thức xử lý với chủng Bacillus-P78, -P81 hoặc -P84 có TLDTLNB thấp (0,42%. - 0,38%, theo thứ tự), tương đương nhau và không khác biệt ý nghĩa với đối chứng dương CuCl 2. - Nhìn chung, qua các thời điểm khảo sát (Bảng 1), ba chủng vi khuẩn Bacillus-P78, -P81 và -P84 cho hiệu quả kích kháng tương đối ổn định hơn so với các chủng vi khuẩn còn lại. - tăng theo thời gian nhưng luôn thấp hơn đối chứng âm và tương đương với đối chứng dương là CuCl 2. - 3.1.2 Hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng Kết quả Bảng 2 cho thấy, các nghiệm thức được xử lý đều thể hiện tính kích kháng, với hiệu quả giảm bệnh (HQGB) cao hơn so với đối chứng âm (nước cất).. - Ở 3 NSKC, các nghiệm thức đều cho HQGB so với đối chứng >60%. - Trong đó, nghiệm thức được xử lý với chủng Bacillus-P29, -P77. - 80% không khác biệt với đối chứng dương CuCl 2. - Bảng 2: Hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng. - của các nghiệm thức qua các thời điểm Nghiệm thức Hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng. - Ở thời điểm 5 và 7 NSKC, hiệu quả giảm bệnh vẫn được duy trì ở hầu hết các nghiệm thức có xử lý kích kháng. - amyloliqueciens cho HQGB cao trong khoảng tương đương đối chứng dương CuCl . - (2013) khi xử lý vi khuẩn Bacillus methylotrophicus BC79 với HQGB đạt được là 89,87%.. - Đến thời điểm 10 NSKC, các nghiệm thức được kích kháng có hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng giảm nhưng vẫn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. - Trong đó, một số nghiệm thức xử lý với chủng Bacillus-P29, -P77, -P78, -P81. - hiệu quả giảm bệnh tương đương với đối chứng dương CuCl . - Nhìn chung, từ kết quả trình bày ở Bảng 2 có thể thấy cây lúa được xử lý bởi các chủng vi khuẩn Bacillus đều có hiệu quả giảm bệnh cao so với đối chứng ở các thời điểm khảo sát. - 3.2 Đánh giá khả năng kích kháng thông qua sự tăng hoạt tính của enzyme liên quan. - 3.2.1 Hoạt tính của enzyme β-1,3- glucanase Kết quả được trình bày ở Bảng 3 cho thấy hoạt tính của β-1,3- glucanase biến động qua các thời điểm khảo sát, cao điểm được ghi nhận vào thời điểm 2 và 5 NSKC (Hình 2).. - Bảng 3: Diễn biến hoạt tính β-1,3- glucanase trong cây lúa ở các nghiệm thức theo thời gian. - Nghiệm thức Hoạt tính β-1,3- glucanase (µM glucose min -1 mg -1 protein) qua các thời điểm khảo sát (ngày sau khi chủng bệnh). - Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức được ghi nhận vào 3 thời điểm 2, 4 và 5 NSKC, trong đó ở thời điểm 2 NSKC cây lúa được xử lý với chủng vi khuẩn Bacillus-P78, -P81, -P84 và B. - amyloliqueciens hoặc CuCl 2 đều có hoạt tính enzyme β-1,3- glucanase, cao hơn có ý nghĩa so với đối chứng không chủng bệnh và với đối chứng chủng bệnh, riêng nghiệm thức xử lý với CuCl 2. - có hoạt tính tương đương đối chứng không chủng bệnh.. - Cây lúa được xử lý với chủng vi khuẩn B.. - amyloliqueciens có sự gia tăng hoạt tính của enzyme β-1,3- glucanase ở cả 3 thời điểm 2, 4 và 5 NSKC và đều cao hơn so với đối chứng chủng. - bệnh hoặc đối chứng không chủng bệnh. - Hoạt tính enzyme β-1,3- glucanase trong cây cao hơn đối chứng chủng bệnh gấp 1,9 lần (thời điểm 2 NSKC), gấp 2,08 lần (thời điểm 4 NSKC), gấp 1,78 lần (thời điểm 5 NSKC) và đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hoạt tính enzyme β- 1,3- glucanase trong cây lúa được xử lý với CuCl 2 . - Cây lúa được xử lý với hai chủng vi khuẩn Bacillus-P81 hoặc Bacillus-P84 có sự gia tăng hoạt tính enzyme β-1,3- glucanase không khác biệt thống kê so với nghiệm thức đối chứng dương ở cả 3 thời điểm 2, 4 và 5 NSKC, nhưng cao hơn đối chứng không chủng bệnh và đối chứng chủng bệnh ở 2 thời điểm 2 và 5 NSKC.. - Hình 2: Tỷ lệ gia tăng β-1,3- glucanase trong cây lúa của các nghiệm thức xử lý kích kháng so với đối chứng có chủng bệnh. - Từ các kết quả trên có thể thấy, hoạt tính enzyme β-1,3- glucanase trong mô cây lúa khỏe (đối chứng không chủng bệnh) và cây lúa không được xử lý kích kháng có chủng bệnh thấp hơn so với trong mô của cây lúa có xử lý kích kháng ở một số thời điểm. - Điều này chứng tỏ tác nhân xử lý có khả năng kích thích cây lúa tạo ra cơ chế bảo vệ của cây lúa để chống lại sự tấn công của nấm gây bệnh cháy lá.. - 3.2.2 Hoạt tính của enzyme chitinase. - Kết quả trình bày ở Bảng 4 cho thấy, hoạt tính của enzyme chitinase trong cây lúa ở các nghiệm thức biến động qua các thời điểm 0 -7 NSKC, trong đó khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức được ghi nhận vào NSKC.. - Ở nghiệm thức đối chứng dương (cây lúa được xử lý với CuCl 2. - sự gia tăng hoạt tính chitinase biểu hiện sớm từ thời điểm 1 NSKC (7,84 đơn vị hoạt tính), cao hơn 147,32% so với đối chứng chủng bệnh (3,17 đơn vị). - Sau đó, hoạt tính. - chitinase giảm dần nhưng vẫn duy trì ở mức cao và khác biệt so với đối chứng chủng bệnh ở các thời điểm 2 NSKC, 5 NSKC, 7 NSKC.. - Ở cây lúa được xử lý với chủng vi khuẩn B.. - amyloliqueciens hoạt tính của chitinase gia tăng ở 3 thời điểm: 1 NSKC, 2 NSKC, 5 NSKC lần lượt là 6,38. - 7,62 và 5,44 đơn vị hoạt tính, với tỷ lệ gia tăng hoạt tính với đối chứng lần lượt là 101,26%;. - 106,06%, và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng chủng bệnh. - Trong đó, thời điểm 2 NSKC cho hoạt tính enzyme chitinase cao nhất, đạt 2,38 lần hơn so với đối chứng chủng bệnh.. - Cây lúa được xử lý với chủng vi khuẩn Bacillus-P84 có hoạt tính enzyme chitinase ở thời điểm 2 NSKC cao hơn so với đối chứng chủng bệnh 109,06%, đạt 6,69 đơn vị hoạt tính so với đối chứng chủng bệnh là 3,20 đơn vị hoạt tính và đối chứng không chủng bệnh là 2,98 đơn vị hoạt tính.. - Đến thời điểm 5 NSKC, hoạt tính enzyme đạt 6,20 đơn vị, với tỷ lệ gia tăng hoạt tính so với đối chứng là 134,85%, và khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so 0.00. - hoạt tính β-1,3-glucanase so với đối chứng chủng bệnh. - với đối chứng chủng bệnh (2,64 đơn vị) và đối chứng không chủng bệnh (2,59 đơn vị).. - Cây lúa được xử lý với chủng vi khuẩn Bacillus-P81 có hoạt tính enzyme chitinase ở thời điểm 2 NSKC cao hơn đối chứng chủng bệnh. - 81,56%, đạt 5,81 µM N-acetylglucosamine giờ -1 mg -1 protein so với đối chứng chủng bệnh là 3,20 µM N-acetylglucosamine giờ -1 mg -1 protein.. - Bảng 4: Diễn biến hoạt tính chitinase trong cây lúa ở các nghiệm thức theo thời gian. - Nghiệm thức Hoạt tính chitinase (µM N-acetyl glucosamine giờ -1 mg -1 protein) trong cây lúa qua các thời điểm (ngày sau khi chủng bệnh). - Hình 3: Tỷ lệ gia tăng hoạt tính chitinase trong cây lúa của các nghiệm thức xử lý kích kháng so với đối chứng có chủng bệnh. - Như vậy, khi được xử lý với các chủng vi khuẩn Bacillus-P81, -P84, B. - amyloliqueciens hoặc CuCl 2 trong cây lúa có sự gia tăng hoạt tính của enzyme chitinase, cao hơn so với ở đối chứng âm chủng bệnh và với đối chứng không chủng bệnh ở 1 số thời điểm. - Các kết quả trên cũng cho thấy hoạt tính của enzyme chitinase biểu hiện sớm hơn và kéo dài hơn so với của enzyme β-1,3- glucanase.. - oryzae, sự gia tăng hoạt tính của các enzyme chitinases và β-1,3- glucanase trong cây ngoài tác động trực tiếp là làm ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh, thì còn có thể. - Trong nghiên cứu này, vi khuẩn xử lý và nấm gây bệnh được giữ không cho tiếp xúc nhau để tránh tác động đối kháng trực tiếp, vì vậy hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng không xử lý của các nghiệm thức xử lý với Bacillus-P81, -P84, B.. - amyloliqueciens và CuCl 2 (Bảng 1 và Bảng 2), có thể do các tác nhân xử lý này đã kích thích được cơ chế kháng của cây lúa, biểu hiện qua sự gia tăng hoạt tính của các enzyme β-1,3- glucanase và 0.00. - hoạt tính chitinase so với đối chứng chủng bệnh. - Sự gia tăng hoạt tính của β-1,3- glucanase và chitinase ở cây có kích kháng đã được ghi nhận trên các loại cây trồng khác nhau. - pumilus 203-6 và 203-7 được chứng minh có liên quan đến sự gia tăng hoạt tính của enzyme peroxidase, chitinase và β-1,3-glucanase, tương ứng (Choudhary and Johri, 2009). - ISR do xử lý với chủng vi khuẩn Pseudomonas azotoformans GC- B19 hoặc Paenibacillus elgii MM-B22, đi cùng với sự tích tụ enzyme β-1,3-glucanase, chitinase, peroxidase (Sang et al., 2014).. - Tùy theo tác nhân kích kháng mà biểu hiện hoạt tính của β-1,3- glucanase và chitinase trong cây kích kháng khác nhau về thời điểm biểu hiện và mức độ gia tăng. - Hoạt tính chitinase và β-1,3- glucanase biểu hiện vào 5 NSKC khi được kích thích bởi vi sinh vật (Dann et al., 1996).. - Trong nghiên cứu này, sự gia tăng của các enzyme β-1,3- glucanase và chitinase trong cây lúa có biểu hiện kích kháng có liên quan đến hiệu quả của các chủng Bacillus hoặc CuCl 2 , qua đó giúp giảm sự lây lan diện tích vết bệnh, TLDTLNB thấp hơn và hiệu quả giảm bệnh cao so với đối chứng chủng bệnh. - Các chủng vi khuẩn Bacillus-P78, -P81, -P84, B. - amyloliquefaciens có khả năng kích kháng cây lúa ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng chống lại bệnh cháy lá do nấm P.oryzae gây ra.. - Có sự gia tăng hoạt tính các enzyme β-1,3- glucanase và chitinase trong cây lúa được kích kháng, và sự gia tăng hoạt tính các enzyme này trong cây lúa có liên quan đến khả năng kích kháng chống lại bệnh cháy lá lúa của các chủng Bacillus này. - Khảo sát khả năng kích kháng bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia grisea (Cooke) Sacc. - Nghiên cứu khả năng kích kháng lưu dẫn của một số hóa chất đối với bệnh cháy lá lúa Pyricularia grisea (Cooke) Sacc