Khảo sát đặc điểm enzyme protease thịt đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sau quá trình tinh sạch sơ bộ

- KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM ENZYME PROTEASE THỊT ĐẦU TÔM THẺ.
- Mục đích của nghiên cứu là xác định tác động của nhiệt độ (30 ÷ 80°C) và pH (5 ÷ 11) đến hoạt động của enzyme protease.
- Tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng với 2 thừa số nhiệt độ và pH bao gồm 11 đơn vị nghiệm thức.
- Bên cạnh đó, độ bền nhiệt của protease được đánh giá ở các mức nhiệt độ khác nhau (30 ÷ 80°C) trong 60 phút và các thông số động học K m , V max của enzyme protease nội tại cũng được khảo sát.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp cho hoạt động enzyme protease tương ứng 60 o C và 7,0.
- Kết quả tối ưu hóa hoạt động protease dựa trên hai nhân tố nhiệt độ và pH là 54,40 o C và pH 6,96.
- Sử dụng enzyme như một công cụ hỗ trợ có nhiều ưu điểm so với sử dụng hóa chất, trong đó có độ đặc hiệu cao, hiệu quả của xúc tác ở nhiệt độ vừa phải và thân thiện với môi trường.
- Từ trước đến nay, enzyme protease được sản xuất chủ yếu từ vi khuẩn và nấm mốc do hoạt tính và hiệu suất thu hồi cao, chỉ một số ít được thu hồi từ động vật và thực vật.
- Nguyên liệu thịt đầu tôm thẻ sau khi phân tách (loại bỏ vỏ, chân hàm, râu) tại nhà máy Chế biến thủy sản xuất nhập khẩu Hòa Trung (huyện Cái Nước, tỉnh Cà Mau) được xử lý sơ bộ và làm ráo nước trước khi phân chia thành các mẫu có khối lượng xác định, bao gói trong bao bì PA và cấp đông ở nhiệt độ -35°C đến -40°C cho đến khi nhiệt.
- độ tâm đạt -18°C, tiến hành trữ đông ở nhiệt độ - 20 ± 2°C..
- thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Đức.
- nhiệt độ 50°C với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1:.
- Tiến hành kết tủa bằng ethanol 99,5% và được làm lạnh đến nhiệt độ -18°C.
- nhiệt độ 30 o C, với thể tích dung dịch đệm bổ sung vào tủa sao cho bằng thể tích dịch trích sử dụng để kết tủa (Trần Thanh Trúc và ctv., 2014).
- Xác định hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ..
- Hoạt tính protease: Theo phương pháp Anson cải tiến (1938) sử dụng casein như cơ chất.
- Hoạt tính tương đối được tính dựa trên so sánh % sự thay đổi hoạt tính ở các mức nghiệm thức của các nhân tố (nhiệt độ, pH) phản ứng khác nhau..
- 2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ.
- Protease sau tinh sạch sơ bộ hòa tan vào trong dung dịch đệm phosphate pH 7,6 (1 mg/mL) và ủ ở 6 mức nhiệt độ khác nhau, từ 30 đến 80C (khoảng cách 10C) trong thời gian 10 phút.
- Xác định hoạt tính của protease tại các nhiệt độ trên.
- Thí nghiệm được thực hiện nhằm tìm ra nhiệt độ tốt nhất cho hoạt động của enzyme protease.
- Thí nghiệm được tiến hành tương tự thí nghiệm 1, enzyme protease xử lý ở các mức nhiệt độ từ 30 đến 80C (bước nhảy 5°C) theo thời gian từ 60 phút.
- Sau khi xử lý, các mẫu enzyme được làm nguội nhanh và xác định hoạt tính còn lại của protease trong từng mẫu còn lại.
- Kết quả thu nhận được là hoạt tính protease còn lại (hoạt tính tương quan.
- Thí nghiệm được tiến hành tương tự như thí nghiệm 1 với nhiệt độ thích hợp được lựa chọn từ thí nghiệm trước.
- pH 9, 10 và 11 - sử dụng đệm glycine NaOH) và xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến..
- 2.5.4 Thí nghiệm 4: Xác định tương tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tinh protease.
- Thí nghiệm tiến hành với 2 nhân tố X 1 - nhiệt độ thích hợp cho hoạt động protease (thay đổi từ 50 đến 60C) và X 2 – pH (thay đổi từ 6,5 đến 7,5).
- Tương ứng với từng điều kiện khảo sát, lọc và ly tâm, thu tủa và xác định hoạt tính.
- Dựa trên hoạt tính trung bình của protease thu được tương ứng với 11 nghiệm thức, sử dụng chương trình Statgraphics Centrution 16.1 để giải bài toán qui hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, trong đó hàm mục tiêu Y: Hoạt tính enzyme protease (U/g protein).
- X 1 : nhiệt độ (C) và X 2 : pH.
- X 1 X 2 Nhiệt độ (C) pH.
- Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ và pH protease tinh sạch sơ bộ từ thịt đầu tôm thẻ.
- Vẽ đồ thị bề mặt đáp ứng và xác định điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
- Hoạt tính của enzyme protease (U/g protein) sau tinh sạch sơ bộ tương ứng với 11 nghiệm thức.
- Kết quả thu nhận là điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu giúp hoạt động enzyme protease đạt hiệu quả cao nhất..
- 2.5.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (thịt đầu tôm thẻ) đến hoạt tính enzyme protease.
- Thí nghiệm được thực hiện tương tự như thí nghiệm trước với nhiệt độ và pH thích hợp được lựa chọn từ thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2.
- Xác định hoạt tính của chế phẩm enzyme protease thô bằng cơ chất thịt đầu tôm ở các nồng độ thay đổi từ 0 đến 0,6 g/mL trong dung dịch đệm có pH và nhiệt độ phản ứng tối ưu được lựa chọn từ thí nghiệm 4..
- 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ.
- Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng của enzyme.
- Bảng 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của protease.
- Nhiệt độ khảo sát (°C).
- Hoạt tính tương đối.
- Kết quả thí nghiệm từ Bảng 2 cho thấy, ở giai đoạn đầu của quá trình gia tăng nhiệt độ (30÷40°C), hiệu quả hoạt động của enzyme cũng tăng dần với hoạt tính tương đối khoảng so với điểm nhiệt độ đạt cao nhất, trường hợp này là 60C).
- Ở giai đoạn cuối của quá trình gia tăng nhiệt độ (70÷80°C), hoạt tính enzyme bắt đầu giảm dần, hoạt tính tương đối vào khoảng .
- Sự giảm hoạt tính này có thể được giải thích do sự biến tính nhiệt phá hủy các hoạt động của các phân tử enzyme.
- Khi enzyme được gia nhiệt, các phân tử đóng vai trò trung tâm hoạt động của enzyme bị phá vỡ, trung tâm hoạt động bị bất hoạt, enzyme bị biến đổi và Khảo sát nhiệt độ và pH.
- Quy hoạch thực nghiệm 2 biến, cấu trúc có tâm (Nhiệt độ: -1,41.
- Xác định hoạt tính protease Thịt đầu tôm thẻ.
- Enzyme protease hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ 40÷60°C và thể hiện hoạt tính cao nhất ở 60°C, thấp hơn so với protease từ gan tụy và đầu tôm sú (Nguyễn Lệ Hà, 2011) là 62 o C hay nội tạng tôm P..
- Kết quả từ đồ thị ở Hình 2 cho thấy sự vô hoạt nhiệt protease từ thịt đầu tôm thẻ phụ thuộc lớn vào nhiệt độ xử lý.
- Tốc độ vô hoạt nhiệt tăng khi tăng nhiệt độ xử lý từ 60 đến 70°C..
- Hoạt tính enzyme khi tăng nhiệt độ lên 65°C giảm chỉ còn 46, 23% so với hoạt tính ban đầu và gần như hoàn toàn mất hoạt tính ở 80°C chỉ còn 7,44%.
- so với hoạt tính ban đầu..
- Lệ Hà (2011), hoạt tính enzyme hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 37÷57°C, hoạt tính bắt đầu giảm và gần như hoàn toàn mất hoạt tính ở 77°C..
- (2000) cho thấy, mặc protease từ gan tụy của tôm Penaelis orientalis có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 70C nhưng lại mất hoạt tính đáng kể ở chính nhiệt độ này khi thời gian ủ dài (30 phút).
- Nhìn chung, hầu hết các protease bền nhiệt ở khoảng nhiệt độ 50÷60C và giảm hoạt tính đáng kể ở nhiệt độ cao hơn và thời gian ủ kéo dài (Dendinger and O’Connor, 1990).
- bởi vì hầu hết các vi sinh vật gây thối không phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ cao mà ở đó protease tôm thẻ vẫn hoạt động tốt 37÷55°C, thậm chí ở 60°C..
- Khảo sát mức độ ảnh hưởng pH đến hoạt tính của enzyme protease từ thịt đầu tôm thẻ ở khoảng pH 5÷11, kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3..
- Bảng 3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease từ thịt đầu tôm thẻ.
- pH khảo sát Hoạt tính tương đối.
- Hoạt tính tương đối,.
- Nhiệt độ (°C).
- Kết quả ở Bảng 3 cho thấy ngoài ảnh hưởng của nhiệt độ, enzyme cũng rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, hoạt tính enzyme protease có giá trị thay đổi theo các giá trị pH đã khảo sát và hoạt tính cao nhất đạt được ở pH 7..
- Trong điều kiện khảo sát, khi pH của môi trường tăng từ giá trị 5 đến 6, hoạt tính protease có xu hướng tăng với hoạt tính tương đối tăng từ khi so sánh với hoạti tính enzyme ở pH 7.
- Trong khi đó, nghiên cứu tiếp tục tiến hành ở khoảng pH cao hơn, vượt qua khỏi điểm pH tối ưu, hoạt tính enzyme giảm dần và giảm rất đáng kể ở khoảng pH 8÷11, hoạt tính tương đối chỉ còn 87,02% ở pH 9 và 44,82% ở pH 11 so với hoạt tính của protease ở điểm pH 7.
- pH 6,6÷7,0 và giảm mạnh hoạt tính khi pH biến đổi về cả hai phía acid và kiềm, thấp hơn so với protease từ gan tụy và đầu tôm sú (Nguyễn Lệ Hà, 2011) pH tốt nhất là 7,5 hay pH tối ưu CPE protease từ đầu tôm biển là pH 8,5 (Phạm Thị Trân Châu, 2013)..
- 3.4 Ảnh hưởng của tương tác nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease.
- X 1 : Nhiệt độ .
- Kết quả cho thấy giá trị P của các lần lặp lại của thí nghiệm (block) có giá trị P = 0,9891 (gần bằng 1), chứng tỏ độ tin cậy của kết quả đo đạc giá trị protease tương ứng với điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau.
- Sự tương tác của nhiệt độ và pH được thấy rõ qua biểu đồ ở Hình 3..
- Hình 3: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ.
- Từ đồ thị tổng quát biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease thu nhận ở Hình 3 cho thấy hai nhân tố này thật sự có sự ảnh hưởng đồng thời đến hoạt động enzyme.
- Với nhiệt độ thấp và pH thấp hoạt động của enzyme protease tăng cao, trong khi đó, nếu nâng nhiệt độ và pH lên cao sẽ cho hoạt tính enzyme protease kém.
- Hoạt tính protease U/g.
- Nhiệt độ ( o C).
- thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở Hình 4 một lần nữa khẳng định cả hai yếu tố pH và nhiệt độ đều ảnh hưởng đến hoạt động protease từ thịt đầu tôm thẻ.
- Phương trình thực nghiệm tối ưu hóa hai nhân tố nhiệt độ và pH đối với hoạt động của enzyme protease thông qua kết quả thí nghiệm có được là:.
- Giải phương trình (1) thu được giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme sau tinh sạch sơ bộ từ thịt đầu tôm thẻ tương ứng với X 1 (nhiệt độ.
- Hình 4: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và pH.
- đến hoạt tính của enzyme protease sau tinh sạch sơ bộ Dựa theo kết quả thu được trên Hình 4, hoạt.
- tính protease trong thịt đầu tôm thẻ tăng đều ở pH 6,5 đến 7,0 với điều kiện nhiệt độ 50 và 55C và giảm dần theo pH acid và pH kiềm ở các nhiệt độ cao hơn.
- Nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt tính protease khá rõ, khi nhiệt độ tăng từ 55°C lên thành.
- 60°C thì hoạt tính protease bắt đầu giảm mạnh..
- Hoạt tính protease thu được từ thực nghiệm và tính toán theo phương trình có độ tương thích cao ở giá trị R Hình 5)..
- Hệ số tương quan cho biết 91,92% sự biến đổi hoạt tính.
- Hoạt tính protease được tính (U/g).
- Hoạt tính protease thực nghiệm (U/g).
- Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính protease trong thịt đầu tôm thẻ sau tinh sạch sơ bộ tăng đều từ nhiệt độ 50 đế 55 o C đối với điều kiện pH 6,5 đến 7,0 và giảm dần khi tăng từ pH 7 đến ph 7,5.
- Hoạt tính đạt tối ưu với nhiệt độ ở 54,40°C và pH 6,96..
- 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme protease.
- có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzyme protease.
- Tuy nhiên, sự liên hệ này chỉ giới hạn đến một nồng độ nhất định nào đó và ở các nồng độ cơ chất cao hơn thì hoạt tính protease hầu như không có sự thay đổi..
- (1990) đã chứng minh rằng sự tăng nồng độ cơ chất vượt qua nồng độ tối ưu sẽ không làm tăng hoạt tính enzyme..
- Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính của protease thể hiện cao nhất ở nhiệt độ 60°C, pH môi trường 7,0, enzyme protease bền ở nhiệt độ 55°C..
- Hoạt động protease đạt tối ưu ở điều kiện nhiệt độ 54,40 o C và pH = 6,96.
- Sự tăng nồng độ cơ chất thịt đầu tôm sẽ thúc đẩy sự gia tăng hoạt tính enzyme.
- Hoạt tính tăng nhanh khi tăng nồng độ cơ chất từ 0÷0,6 (g/mL), khi đó vận tốc cực đại V max.
- Nghiên cứu trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon)