- KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID, ALKALOID VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT CỎ MẦN TRẦU (Eleusine indica). - Alkaloid tổng, cỏ Mần Trầu, flavonoid tổng, kháng khuẩn Keywords:. - Cỏ Mần Trầu (Eleusine indica) chứa nhiều hợp chất tự nhiên với hoạt tính kháng khuẩn. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp ly trích thông thường so với phương pháp ly trích có kết hợp sóng siêu âm lên hoạt tính các hợp chất kháng khuẩn.. - Khả năng kháng khuẩn ở tất cả nghiệm thức là khá tốt, khả năng kháng đối với Escherichia coli cao hơn so với Bacillus subtilis. - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết S70 tương ứng hai dòng vi khuẩn trên là 12,5 mg/mL và 50 mg/mL.. - Khảo sát hàm lượng flavonoid, alkaloid và khả năng kháng khuẩn của cao chiết cỏ Mần Trầu (Eleusine indica). - Cỏ Mần Trầu có tên khoa học là Eleusine indica (L.) Gaertn, thuộc họ Hòa Bản (Poaceae) (Phạm Hoàng Hộ, 1999). - Theo Đông y, cỏ Mần Trầu là một vị thuốc có rất nhiều lợi ích, bao gồm các tác dụng như làm mát cơ thể, giảm đau, trị tóc bạc sớm, viêm khớp, viêm ruột, nhuận tràng, nhuận gan, giải độc, chữa cảm sốt. - Mần Trầu còn có tác dụng kích thích tiêu hóa, lợi tiểu, trị giun sán, huyết áp cao hay điều trị rối loạn bàng quang. - Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy cỏ Mần Trầu chứa các chất biến dưỡng thứ cấp như alkaloid, flavonoid, phenol, steroid, tannin, coumarin và saponin (Banglacod et al., 2012. - Song song đó, các hoạt tính kháng khuẩn từ cỏ Mần Trầu cũng được báo cáo (Alaekwe et al., 2015. - Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về cỏ Mần Trầu còn khá hạn chế. - Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra phương pháp ly trích hiệu quả và khảo sát hoạt kháng khuẩn của cỏ Mần Trầu là rất cần thiết.. - Cỏ Mần Trầu khỏe mạnh, không sâu bệnh ở ven sông Hậu, quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ. - Hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis được cung cấp bởi phòng Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học. - 2.2 Phương pháp. - 2.2.1 Điều chế cao chiết cỏ Mần Trầu Nghiền nhỏ 500 g cỏ Mần Trầu (bao gồm cả rễ thân và lá) bằng máy xay. - Dịch chiết ở cả hai phương pháp đem đi cô quay và thu được 4 loại cao chiết có ký hiệu K70, S70, K96, S96. - 2.2.2 Định tính các hợp chất tự nhiên. - Alkaloid 2 ml cao chiết + 3-4 giọt thuốc thử Wagner Tủa màu vàng Flavonoid 1 ml cao chiết + 1 ml Pb(CH 3 COOH) 2 (10%) Màu vàng. - Saponin 2 ml cao chiết + vài giọt dầu oliu + đun nóng trong 2 phút Nhũ tương màu sữa Terpenoid 2 ml cao chiết + 2 ml chloroform + vài giọt H 2 SO 4 đậm đặc Màu xanh ngọc bích. - Coumarin 2 ml cao chiết + 3 mL NaOH 10% Màu vàng. - Quinone 2 ml cao chiết + vài giọt HCl đậm đặc Màu xanh lá cây Phenol và Tannin 2 ml cao chiết + 2 ml H 2 O+ 2-3 FeCl 3 (5%) Tủa màu xanh đen. - Hàm lượng flavonoid tổng được biểu diễn theo miligram đương lượng quercetin trên gram cao chiết (mg QE/g cao chiết).. - Hàm lượng alkaloid tổng được biểu diễn theo miligram đương lượng atropine trên gram cao chiết (mg AE/g cao chiết).. - 2.2.5 Khảo sát khả năng kháng khuẩn. - Xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết cỏ Mần Trầu ở nồng độ 100 mg/mL. - Chuẩn bị thí nghiệm: 4 loại cao chiết (K70, S70, K96, S96) được pha trong DMSO 30% để đạt nồng độ 100 mg/mL. - Huyền phù 2 dòng vi khuẩn Bacillus subtilis và Escherichia coli được nuôi cấy trong môi trường LB, ủ ở 37 o C sau 24 giờ có mật số tương đương 10 6 CFU/mL.. - Hút 50 µL dịch huyền phù vi khuẩn của mỗi dòng vi khuẩn trải đều trên môi trường đĩa thạch LB. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC). - Dựa vào thí nghiệm kháng khuẩn trên đĩa thạch chọn ra nghiệm thức cao chiết. - hiệu quả đối với 2 dòng vi khuẩn để khảo sát giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết cỏ Mần Trầu.. - Chuẩn bị thí nghiệm: cao chiết được pha loãng trong DMSO 30% theo dãy nồng độ 75. - Bổ sung thêm 250 µL dịch huyền phù vi khuẩn được nuôi trong 24 giờ ở 37 o C đạt mật số tương đương 10 6 CFU/mL. - Cuối cùng, bơm 50 µL cao chiết ở các nồng độ khác nhau, đối chứng âm (DMSO 30%) và đối chứng dương (ampicillin 10 µg/mL). - Tiến hành đếm mật số vi khuẩn ở mỗi nồng độ khảo sát bằng phương pháp pha loãng mẫu và đếm trên môi trường đĩa thạch (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009).. - MIC là giá trị mà ở đó nồng độ cao chiết thấp nhất có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn.. - MBC là giá trị mà ở đó nồng độ cao chiết thấp nhất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn.. - MIC 50 là giá trị mà ở đó nồng độ cao chiết có hiệu quả ức chế 50% sự phát triển của vi khuẩn.. - 3.1 Hiệu suất ly trích cao chiết cỏ Mần Trầu Hiệu suất ly trích cao chiết cỏ Mần Trầu được trình bày trong Bảng 2.. - Bảng 2: Hiệu suất ly trích cỏ Mần Trầu Các loại cao cỏ Mần. - Bảng 2 cho thấy hiệu suất ly trích cỏ Mần Trầu ở tất cả các nghiệm thức nhỏ hơn 1%. - Nghiệm thức K96 mang lại khối lượng cao chiết tốt nhất với 2,68 gram sau khi được ly trích từ 500 gram khối lượng mẫu ban đầu.. - Riêng chỉ có thử nghiệm phenol và tannin là không thấy sự hiện diện, có thể là do hàm lượng các hợp chất này trong cao chiết thấp hơn ngưỡng phát hiện của thử nghiệm này.. - (2015) cũng sử dụng nguyên liệu là cỏ Mần Trầu ly trích bằng dung môi chloroform và tái chiết với dung môi methanol với phương pháp ngâm trong 24 giờ. - Bảng 3: Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong cao chiết cỏ Mần Trầu Thử nghiệm K70 S70 K96 S96. - Flavonoid và alkaloid là hai trong những nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học và đặc biệt là kháng khuẩn (Moura et al., 2007. - Do đó, định lượng flavonoid tổng và alkaloid tổng là hai chỉ tiêu quan trọng nhằm đánh giá khả năng kháng khuẩn từ cỏ Mần Trầu.. - Nghiệm thức S70 có hàm lượng flavonoid tổng và alkaloid tổng cao nhất, tương ứng 93,11 mg QE/g cao chiết và 128,5 mg AE/g cao chiết. - Có thể thấy, nhờ vào sự kết hợp chiếu xạ siêu âm với khả năng tạo các bọt khí nhỏ giúp sự khuếch tán các nhóm chất từ nguyên liệu vào dung môi tốt hơn, giúp hỗ trợ khuếch tán các hợp chất tự nhiên khi ly trích từ thực vật (Suslick, 1985). - dưới 1%, điều này dẫn tới khả năng cao chiết cỏ Mần Trầu có hoạt tính sinh học cao.. - Cao chiết. - 3.4 Khả năng kháng khuẩn với 2 dòng vi khuẩn Bacillus subtilis và Escherichia coli. - Khả năng kháng khuẩn ở nồng độ cao chiết 100 mg/mL. - Sau 24 giờ, tất cả nghiệm thức cỏ Mần Trầu đều có khả năng kháng 2 dòng vi khuẩn B. - Theo nghiên cứu Tiwari and Cummins (2011) cỏ Mần trầu có chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học là những hợp chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, saponin, alkaloid. - Tất cả các hoạt chất thực vật này đều có khả năng kháng khuẩn. - Như việc flavonoid liên kết với adhesin – yếu tố độc lực của vi khuẩn Gram âm và ức chế giải phóng acetylcholine – thành phần lớp phospholipid ở màng tế bào làm mất chức năng của chúng. - Bảng 5: Kết quả khả năng kháng B. - coli ở nồng độ 100 mg/mL của cao chiết cỏ Mần Trầu. - Nghiệm thức. - coli của cao chiết cỏ Mần Trầu tốt hơn so với B. - Các nghiệm thức có nồng độ dung môi 70% đều cho thấy khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với dung môi có nồng độ 96%. - mang lại khả năng ức chế vi khuẩn tốt hơn gấp 1,5 lần so với dung môi ethanol 96%. - Điều này là do mỗi loại dung môi khác nhau sẽ mang lại các hợp chất tự nhiên cũng khác nhau, từ đó khả năng kháng khuẩn cũng khác nhau (Okokon et al., 2010;. - Pandey et al., 2015), mang lại khả năng kháng khuẩn tốt hơn.. - Khả năng kháng khuẩn theo thời gian. - Khả năng kháng khuẩn theo thời gian của các loại cao chiết với 2 dòng vi khuẩn B. - Nguyên nhân là do khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi như gặp chất ức chế hay diệt khuẩn trong môi trường sống của chúng, chúng sẽ phát triển rất khó khăn. - Trong đó, những hợp chất tự nhiên có những cách ức chế vi khuẩn khác nhau. - Ví dụ, terpenoid gây phá vỡ màng tế bào, quinone liên kết các thành phần bề mặt màng ngoài, flavonoid ảnh hưởng hoạt động của các enzyme tạo thành peptidoglycan, alkaloid xen vào cấu trúc acid nucleic (Tiwari and Cummins, 2011) làm cho vi khuẩn liên tục bị ức chế, giúp khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết được tốt hơn.. - Khả năng diệt khuẩn B. - Điều này là do vi khuẩn đã dần thích nghi với môi trường bằng cách tự biến đổi gene diễn ra tự phát bên trong hoặc nhận một gen kháng từ bên ngoài (Dzidíc et al., 2008). - Hầu hết các chất kháng khuẩn đều khuếch tán vào bên trong tế bào vi khuẩn. - Sự khuếch tán này phụ thuộc vào kích thước, tính ưa nước và kị nước của chất kháng khuẩn. - Do đó, vi khuẩn cần tạo ra nhiều loại enzyme có thể làm bất hoạt chất kháng khuẩn, protein kênh bơm chất kháng khuẩn ra khỏi tế bào, methyl hóa các mục tiêu gắn kết với chất kháng khuẩn hoặc tạo màng sinh học (biofilm) hạn chế tiếp xúc với chất kháng khuẩn (Kumar et al., 2011).. - Đối với vi khuẩn E. - coli (Hình 5) khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết theo thời gian cho thấy sự kém hiệu quả so với B. - Ở mốc thời gian 48 giờ, các loại cao chiết có xu hướng giảm hoạt tính kháng khuẩn đối với E. - Trong khi đó, ở các mốc thời gian từ 72 giờ đến 96 giờ, khả năng kháng B.. - subtilis của các nghiệm thức S70 và K70 cao gấp 5 lần khả năng kháng E. - Hình 4: Biểu đồ hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết cỏ Mần Trầu ở nồng độ 100 mg/mL đối với Bacillus subtilis theo thời gian. - Hình 5: Biểu đồ hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết cỏ Mần Trầu ở nồng độ 100 mg/mL đối với Escherichia coli theo thời gian. - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết S70. - Dựa vào kết quả các thí nghiệm trước, nghiệm thức S70 có khả năng kháng khuẩn tốt đối với 2 dòng vi khuẩn trên, cho nên được chọn để xác định giá trị MIC và MBC của cao chiết cỏ Mần Trầu.. - Nồng độ cao chiết càng giảm thì sự phát triển của vi khuẩn càng tăng và có sự khác nhau giữa vi khuẩn B. - Như vậy, giá trị MIC và MBC của cao chiết S70 đối với vi khuẩn B. - đối với vi khuẩn E. - Bảng 6 cho thấy MIC 50 của cao chiết S70 đối với 2 dòng vi. - Bảng 6: Kết quả MIC và MBC của cao chiết S70 Nồng độ nghiệm. - Sự phát triển của vi khuẩn. - Cùng một nghiệm thức cao S70 mà hoạt tính kháng khuẩn của nó lại rất khác nhau giữa 2 dòng vi khuẩn B. - bào 2 dòng vi khuẩn này. - Vi khuẩn Gram âm dễ nhạy cảm với chất kháng khuẩn hơn vi khuẩn Gram dương vì các chất kháng khuẩn có tính kị nước khuếch tán qua lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm và được giữ trong khoảng gian bào. - Khi đó, chất kháng khuẩn dễ tác động vào tế bào vi khuẩn (Braum, 2002). - Như vậy, nồng độ ức chế tối thiểu của S70 đối với E. - Hiệu suất ly trích cỏ Mần Trầu ở tất cả nghiệm thức đều thấp, nhưng vẫn mang lại hàm lượng flavonoid tổng, alkaloid tổng và khả năng kháng khuẩn tốt. - Đặc biệt, ở phương pháp ly trích cỏ Mần Trầu sử dụng dung môi ethanol khi có kết hợp chiếu xạ siêu âm có hàm lượng flavonoid tổng, alkaloid tổng cao hơn phương pháp truyền thống.. - Khả năng kháng khuẩn của tất cả nghiệm thức đối với vi khuẩn Escherichia coli hiệu quả hơn so với Bacillus subtilis. - Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với 2 dòng vi khuẩn trên tương ứng là 12,5 mg/mL và 50 mg/mL.