- KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỐI TRÁI CỦA TINH DẦU QUẾ (Cinnamomum verum). - Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu đánh giá hoạt tính ức chế của tinh dầu quế (Cinnamomum verum) đối với các dịng nấm mốc gây thối được phân lập từ trái dâu tây, đu đủ, mận và xồi. - Các dịng nấm được phân lập trên mơi trường PDA, định danh thơng qua hình thái khuẩn lạc, sợi nấm, bào tử và trình tự ITS. - Kết quả cho thấy bốn dịng nấm mốc gây thối trái bao gồm hai dịng nấm Fusarium sp., một dịng nấm Lasiodiplodia sp. - và một dịng nấm Diaporthe sp. - Tinh dầu quế ức chế hồn tồn sự tăng sinh sợi nấm của bốn dịng nấm ở nồng độ 0,4 µL/mL bằng phương pháp khuếch tán mơi trường thạch và ngăn chặn hồn tồn bào tử nấm nảy mầm của hai dịng Fusarium sp. - bằng phương pháp vi lỏng với cùng nồng độ. - Giá trị MIC của tinh dầu đối với 4 dịng nấm bằng phương pháp khuêch tán đĩa thạch là 0,3 – 0,4 µL/mL và bằng phương pháp vi lỏng là 0,4 µL/mL với dịng TB1 và 0,2 µL/mL với dịng TB2. - Giá trị MFC của tinh dầu là 0,3 – 0,6 µL/mL đối với các dịng nấm thơng qua phương pháp khuếch tán đĩa thạch và bằng phương pháp vi lỏng là 0,2 - 0,4 µL/mL.. - Leong et al., 2004).. - Wilson et al., 1999). - Trong đĩ, tinh dầu là chất được sử dụng rộng rãi và lâu đời, một số lượng lớn các loại tinh dầu và thành phần của tinh dầu đã được nghiên cứu về đặc tính chống lại một số nấm.. - Tinh dầu quế (Cinnamomum verum) được cung cấp từ Trung tâm Bảo tồn Giống dược liệu Hịa An, xã Xuân Hịa, huyện Kế Sách, tỉnh Sĩc Trăng. - Phương pháp. - Phân lập và định danh các dịng nấm gây thối trái. - Sản phẩm PCR của các dịng nấm được giải trình tự theo phương pháp Sanger, sau đĩ so sánh trình tự thu được với trình tự trên ngân hàng gene NCBI để so sánh trình tự bộ gene và định danh nấm phân lập.. - Xác định hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quế bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. - Đánh giá hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quế được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trong mơi trường thạch theo mơ tả của Euloge et al.. - Nồng độ tinh dầu trong mơi trường (0,05;. - 0,5 và 0,6 µL/mL) đã được điều chỉnh bằng cách thêm lượng tinh dầu C. - Tỷ lệ phần trăm sự ức chế tăng trưởng sợi nấm bằng tinh dầu được tính theo cơng thức của Philippe et al. - Ức chế tăng trưởng sợi nấm. - dc: đường kính của khuẩn lạc mẫu đối chứng dt: đường kính của khuẩn lạc trong mẫu chứa tinh dầu.. - Nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) của tinh dầu được xác định bằng cách cấy các đĩa nấm bị ức chế bởi tinh dầu khơng cĩ sự sinh trưởng, phát triển khuẩn ty vào mơi trường PDA (glucose 20g/L, khoai tây 200g/L, agar 20g/L, pH = 7). - Nồng độ diệt nấm tối thiểu được xác định là nồng độ thấp nhất của tinh dầu mà tại nồng độ đĩ khơng cĩ sự tăng trưởng xảy ra trên các đĩa sau khi cấy.. - Xác định hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quế bằng phương pháp vi lỏng và mật độ quang (OD). - Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng nấm bằng tinh dầu được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên bằng các mẫu nấm gây thối trái được phân lập (Gakuubi et al., 2017). - Chuẩn bị huyền phù bào tử nấm bằng cách cấy nấm trên mơi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phịng từ 5 -7 ngày để nấm sinh bào tử. - Thêm vào ống nghiệm 0,75 mL tinh dầu được điều chỉnh bằng dung dịch Tween 80 nồng độ 0,5% (v/v) để nồng độ tinh dầu trong mơi trường lần lượt 0,1. - Các ống đối chứng âm lần lượt được cho 0,75 mL Tween 80 nồng độ 0,5%. - Sau đĩ, chủng 3 mL dung dịch huyền phù bào tử nấm vào các ống nghiệm chứa mơi trường đã được chuẩn bị và lắc ở nhiệt độ 28 o C. - Sau 72 giờ lắc, rút khoảng 50 µL dịch nuơi cấy từ các ống nghiệm nuơi lỏng bào tử nấm và trải lên đĩa mơi trường PDA và được ủ ở nhiệt độ 28 o C ± 2 trong 3 ngày. - Giá trị MFC được xác định là nồng độ tinh dầu thấp nhất cho thấy khơng cĩ sự tăng trưởng hoặc ít hơn ba khuẩn lạc nấm (hoạt động tiêu diệt khoảng 99% đến 99,5%) khi cấy trên mơi trường đĩa thạch.. - Từ bốn mẫu trái cây bị thối, tiến hành phân lập được bốn dịng nấm mốc trên mơi trường PDA. - Theo quan sát hình thái đại thể và vi thể dưới kính hiển vi của dịng nấm TB1 và TB2 phân lập từ mẫu dâu tây và đu đủ phát triển trên mơi trường PDA sau ba ngày, tản nấm phát triển hình dạng trịn cĩ đường kính khoảng 30 mm, hệ sợi nấm cĩ vách ngăn, dạng sợi đa bào và tạo ra bào tử dài, cĩ vách ngăn, hình liềm, thân cong, hai đầu thuơn nhọn (Hình 1 và Hình 2). - Kết hợp với kết quả giải trình tự vùng ITS và so sánh với trình tự của các dịng nấm trong cơ sở dữ liệu Genebank của NCBI bằng cơng cụ Blast cĩ độ tương đồng cao nhất là trên 98% đối với dịng TB1 và 91,75% đối với dịng nấm TB2 với. - (2013) từ các kết quả về hình thái của bào tử, sợi nấm và tản nấm cũng như kết quả giải trình tự cĩ sự tương đồng cao, cĩ thể kết luận được dịng nấm TB1 và TB2 là Fusarium sp. - Mehmood et al. - Zakaria et al. - Đặc điểm vi thể của nấm mốc trên mơi trường PDA sau ba ngày Tên dịng Khuẩn ty Hình dạng bào tử. - Hình dạng của dịng nấm TB1 (A: mặt trên khuẩn lạc, B: mặt dưới khuẩn lạc,C: khuẩn ty ở vật kính 40X, D: bào tử ở vật kính 40X). - Dịng nấm TB3 được phân lập từ mẫu mận cĩ hệ sợi nấm phát triển rất nhanh, chỉ sau hai ngày nuơi cấy trên mơi trường thạch PDA tơ nấm đã tràn khắp đĩa mơi trường, khơng quan sát được hình dạng khuẩn lạc. - Bào tử của dịng nấm TB3 hình thành rất lâu trong quá trình nuơi cấy (khoảng sau 21 ngày). - Từ đĩ các kết quả trên cĩ thể xác định dịng nấm TB3 là Lasiodiplodia sp.. - Hình dạng của dịng nấm TB2 (A: mặt trên khuẩn lạc, B: mặt dưới khuẩn lạc,C: khuẩn ty ở vật kính 40X, D: bào tử ở vật kính 40X). - Hình dạng của dịng nấm TB3 (A: mặt trên khuẩn lạc, B: mặt dưới khuẩn lạc,C: khuẩn ty ở vật kính 40X, D:bào tử ở vật kính 40X). - Dịng nấm TB4 cĩ hình dạng khuẩn lạc khơng đều, khuẩn ty cĩ màu trắng, phần giữa mọc dày hơn, phần bìa mọc phẳng mặt mơi trường,tơ nấm ngắn, khơng mịn, phát triển ra mơi trường theo từng lớp tạo nên các khoảng sinh trưởng rõ rệt. - Sợi nấm khi quan sát dưới kính hiển vi cĩ vách ngăn, phân nhánh, sợi đa bào và bào tử hình elip đến oval, trong suốt và khơng cĩ vách ngăn (Hình 4). - Diaz et al. - (2014), Diaporthe pseudomangiferae là mầm bệnh gây thối trái và hư hại hoa ở xồi nên cĩ thể xác định dịng nấm TB4 là Diaporthe sp.. - Hình dạng của dịng nấm TB4 (A: mặt trên khuẩn lạc, B: mặt dưới khuẩn lạc, C: khuẩn ty ở vật kính 40X, D: bào tử ở vật kính 40X). - Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quế bằng phương pháp khuếch tán mơi trường. - Kết quả khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng sợi nấm của tinh dầu quế với bốn dịng nấm phân lập sau 48 giờ được ghi nhận kết quả trong Bảng 3.. - Phần trăm ức chế sinh trưởng sợi nấm của tinh dầu quế tại thời điểm 48 giờ Nồng độ. - tinh dầu. - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với các dịng nấm. - Hoạt tính kháng nấm trên cả bốn dịng nấm cho thấy cĩ đến ba dịng (TB1, TB2 và TB4) ngừng sinh trưởng hồn tồn ở nồng độ 0,3 µL/mL và ổn định đến hết thời gian khảo sát. - Riêng dịng nấm TB3 bị ức chế 64,58% ở nồng độ 0,3 µL/mL, cịn ở nồng độ 0,4µL/mL ức chế hồn tồn trong 48 giờ. - Đặc biệt, ở nồng độ tinh dầu 0,05 µL/mL, nấm TB1 cĩ sự phát triển mạnh và vượt trội với phần trăm tăng trưởng từ 6,67% khi so sánh với nghiệm thức đối chứng và theo Pernak et al. - ion như: 2-chloroethyltrimethylammonium và trimethylvinylammonium (2,4-dichlorophenoxy) acetates cho thấy hoạt động ức chế sự phát triển và diệt cỏ rất tốt khi sử dụng 440 g/ha nhưng khi sử dụng hoạt chất trên với nồng độ 0,005 M đến 0,01 M thì lại cho kết quả tăng khả năng sinh trưởng như một chất kích thích, điều hịa sinh trưởng thực vật.. - Vì vậy, ở nồng độ tinh dầu thấp (0,05µL/mL) thì cĩ khả năng là chất kích thích cho quá trình tăng trưởng sợi nấm của dịng nấm TB1.. - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu cĩ sự tương đồng giữa dịng nấm TB1 (Fusarium sp. - TB2 (Fusarium sp.) và TB4 (Diaporthe sp.) đều là 0,3 µL/mL. - Giá trị MIC này cũng tương đương với MIC là 0,25 µL/mL khi thử nghiệm khả năng kháng nấm của các loại tinh dầu từ cây thuộc họ Lauraceae với các dịng nấm gây bệnh. - Cịn đối với dịng nấm TB3 (Lasiodiplodia sp. - MIC là 0,4 µL/mL, thấp hơn MIC của tinh dầu trầm hương là 2 mg/mL khi đối kháng với nấm Lasiodiplodia theobromae (Zhang et al., 2014). - Nghiên cứu kháng nấm của tinh dầu quế (Cinnamomum verum) đối với dịng nấm mốc Aspergillus fumigatus cĩ giá trị MIC từ µL/mL và với một số lồi nấm men (Candida albicans, C. - Nồng độ diệt nấm. - tối thiểu (MFC) của tinh dầu với các dịng nấm như dịng TB1 cĩ giá trị MFC là 0,3 µL/mL, dịng TB2 là 0,4 µL/mL, dịng TB3 và TB4 là 0,6 µL/mL.. - Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quế bằng phương pháp vi lỏng và mật độ quang (OD) Do hai dịng nấm TB3 và TB4 là những lồi nấm tạo bào tử sau thời gian dài (khoảng 21 ngày) và số lượng bào tử được sinh ra ít nên chỉ hai dịng nấm TB1 và TB2 được sử dụng để tiến hành khảo sát bằng phương pháp nuơi lỏng.. - Kết quả khảo sát khả năng ngăn sự nảy mầm của bào tử từ hai dịng nấm TB1 (Fusarium sp.) và TB2 (Fusarium sp.) của tinh dầu quế bằng phương pháp vi lỏng được đánh giá qua chỉ số mật độ quang ở bước sĩng 𝜆 = 405 nm (Bảng 4).. - Giá trị mật độ quang (𝜆 = 405 nm) của hai dịng nấm TB1 và TB2. - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với các dịng nấm Tinh dầu quế cĩ hoạt tính ngăn hồn tồn bào tử nấm nảy mầm đối với hai dịng nấm TB1 và TB2 ở nồng độ tinh dầu khá thấp: 0,4 µL/mL với bào tử của dịng TB1 và 0,2 µL/mL đối với bào tử của dịng nấm TB2 ở trong suốt khoảng thời gian 72 giờ khảo sát. - Tuy nhiên khi cĩ tinh dầu với nồng độ 0,1 µL/mL và 0,2 µL/mL trong mơi trường thì đối với dịng TB1 là những chất kích thích, hỗ trợ quá trình nảy mầm và phát triển cịn đối với dịng TB2 khơng cĩ tác dụng mà cĩ tác dụng ức chế. - Từ đây cĩ thể thấy dịng nấm TB2 nhạy cảm với tinh dầu quế hơn dịng nấm TB1 trong thí nghiệm mơi trường lỏng.. - Giá trị MIC của hai dịng nấm TB1 và TB2 đối với tinh dầu cũng khác nhau lần lượt là 0,4 µL/mL và 0,2 µL/mL. - (2004) cĩ giá trị MIC của tinh dầu quế (Cinnamomum sp.) là 0,25 µL/mL đối với nấm Fusarium spp. - và thấp hơn giá trị MIC là 7 - 8 µL/mL khi sử dụng tinh dầu bạch đàn (Eucalyptus. - al., 2017). - Cịn đối với nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) của phương pháp vi lỏng đối dịng nấm TB1 và TB2 lần lượt là 0,4 µL/mL và 0,2 µL/mL. - Giá trị MIC của tinh dầu các cây thuộc chi quế (Cinnamomum spp.) là 0,25 µL/mL đối với nấm Fusarium spp. - (Simić et al., 2004) và MIC là 7-8 µL/mL khi sử dụng tinh dầu bạch đàn (Eucalyptus camaldulensis) trên nấm Fusarium spp. - (Gakuubi et al., 2017). - tinh dầu kinh giới (Origanum syriacum L.) cĩ hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus niger , Fusarium oxysporum và Penicillium spp. - Qua kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của tinh dầu quế với 4 dịng nấm được phân lập, cho thấy tinh dầu cĩ khả năng ức chế sự sinh trưởng sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử nấm hiệu quả với nồng. - năng của việc áp dụng tinh dầu như một loại thuốc chống nấm sinh học rất cao để xử lý các bệnh liên quan với nấm gây bệnh trên trái sau thu hoạch.. - Đề tài phân lập được bốn dịng trong đĩ hai dịng nấm Fusarium sp. - (dâu tây, đu đủ), một dịng nấm Lasiodiplodia sp. - một dịng nấm Diaporthe sp. - Qua khảo sát khả năng ức chế tăng trưởng sợi nấm của tinh dầu quế, thu được kết quả tinh dầu quế ức chế hồn tồn 100% sự tăng trưởng với hai dịng nấm Fusarium sp. - (TB1 và TB2) và một dịng nấm Diaporthe sp. - (TB4) ở nồng độ 0,3 µL/mL. - với dịng nấm Lasiodiplodia sp. - (TB3) ở nồng độ 0,4 µL/mL sau 48 giờ. - Tinh dầu quế cĩ nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 0,3 – 0,4 µL/mL và nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) là 0,3 – 0,6 µL/mL khi khảo sát với bốn dịng nấm thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.. - Thử nghiệm hoạt tính ức chế khả năng nảy mầm của bào tử hai dịng nấm Fusarium sp. - (TB1 và TB2) kết quả thu được tinh dầu quế ức chế hiệu quả khả năng nảy mầm của bào tử thuộc hai dịng nấm Fusarium sp. - với nồng độ từ 0,4 – 1,0 µL/mL kéo dài trong 72 giờ. - Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu quế đối với 2 dịng nấm là 0,4 µL/mL và nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC) được xác định là 0,4 µL/mL bằng phương pháp nuơi cấy vi lỏng.. - Tuyển chọn các dịng nấm mốc Aspergillus spp