- KHẢO SÁT SƠ BỘ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT TỪ VỎ VÀ HẠT BƠ (Persea americana, LAURACEAE). - DPPH, enzym α-glucosidase, kháng oxy hóa, kháng ung thư, vỏ và hạt quả bơ Keywords:. - Bên cạnh đó, phần vỏ và hạt còn chứa rất nhiều dưỡng chất có thể ứng dụng trong ngành dược và mỹ phẩm.. - Đề tài thực hiện với mục tiêu xác định hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế enzym α-glucosidase và kháng ung thư vú (in vitro) của vỏ và hạt bơ Booth 7 (Persea americana, Lauraceae). - Bằng thử nghiệm kháng oxy hóa với DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl), ức chế enzym α-glucosidase và phương pháp sulforhodamin B của các cao chiết ethanol 70% và 96%. - Kết quả cho thấy cả bốn loại cao chiết từ vỏ và hạt đều có khả năng khá oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase. - Đặc biệt là cao hạt bơ chiết với ethanol 96% kháng oxy hóa mạnh nhất (IC mg/mL), thấp hơn đối chứng vitamin C (IC mg/mL) khoảng 11 lần. - Ngược lại, khả năng ức chế enzym α-glucosidase thể hiện mạnh nhất ở cao chiết từ vỏ bơ với ethanol 96% (IC 50 = 2,75 µg/mL), hơn đối chứng dương acarbose (IC 50 = 6,83 µg/mL) khoảng 2,48 lần. - Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư vú của các cao không đáng kể. - Hoạt chất kháng oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase từ vỏ và hạt bơ cần được tiếp tục phân lập và xác định.. - Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của cao chiết từ vỏ và hạt bơ (Persea americana, Lauraceae).. - Stress oxy hóa là trạng thái mất cân bằng của cơ thể khi các gốc tự do vượt quá khả năng điều tiết. - Trong một số điều kiện sinh lý bệnh, trạng thái cân bằng tinh tế giữa sản xuất gốc tự do và khả năng chống oxy hóa bị biến dạng dẫn đến căng thẳng oxy hóa và tăng tổn thương mô. - Các loại oxy phản ứng chủ yếu được sản xuất bởi các tế bào mạch máu có liên quan đến các cơ chế gây bệnh tiềm ẩn trong sự tiến triển của các bệnh tim mạch bao gồm bệnh tim thiếu máu cục bộ, xơ vữa động mạch, rối loạn nhịp tim, tăng huyết áp và đái tháo đường (Randhi et al., 2015). - Ngoài ra, hàm lượng đường và insulin trong máu tăng cao cũng là nguyên nhân gây ra các bệnh ung thư về gan, tụy, thận, vú, đại trực tràng, tuyến tiền liệt … (Monami et al., 2009).. - Tuy nhiên, đa phần mọi người chỉ biết đến giá trị dinh dưỡng có trong thịt quả bơ mà không để ý đến giá trị của vỏ và hạt. - Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng chữa bệnh của vỏ và hạt trái bơ: kháng oxy hóa, kháng ung thư, kháng khuẩn, tác dụng bảo vệ gan… (Qing-Yi et al, 2005. - dầu chiết từ hạt có tác dụng nuôi dưỡng, bảo vệ da. - Nhằm tận dụng tối đa giá trị của quả bơ, đề tài nghiên cứu “Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của cao chiết từ vỏ và hạt bơ (Persea americana, Lauraceae)” được thực hiện với các mục tiêu khảo sát các hoạt tính: kháng oxy hóa, ức chế enzym α- glucosidase và kháng ung thư.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Vỏ và hạt bơ Booth 7 được mua (quán Ice Summer-205, Nguyễn Thị Minh Khai) ở thành phố Cần Thơ từ tháng 10 - 11 năm 2017.. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa: ethanol, methanol (Trung Quốc), 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma, USA), acid ascorbic (vitamin C) (Sigma, USA).. - Khảo sát hoạt tính kháng enzym α-glucosidase:. - Khảo sát hoạt tính kháng ung thư vú: môi trường Eagle's minimal essential medium (E’MEM), L- glutamin, acid 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic (HEPES), amphotericin B, penicillin G, streptomycin, huyết thanh bào thai bò FBS (fetal bovine serum), dung dịch acid trichloroacetic, dung dịch sulforhodamin B 0,2%.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết cao. - 2.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng thử nghiệm DPPH (Nguyễn Thị Thu Hương, 2006). - Mẫu thử: cao chiết được hòa tan với methanol để đạt được nồng độ 50 µg/mL. - Đối chứng dương được sử dụng là acid ascorbic pha với nồng độ 10 µg/mL. - Cách tính kết quả. - Hoạt tính chống oxy hóa HTCO. - Phân tích số liệu trên phần mềm Excel được phương trình logarit giữa nồng độ mẫu thử và HTCO. - Giá trị IC 50 càng thấp tương ứng với HTCO càng cao và ngược lại. - Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị trung bình của 3 lần đo khác nhau. - 2.2.3 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase. - Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase in vitro tiến hành theo phương pháp của Mahomoodally and Muthoora (2014) có cải biên.. - Khi có mặt chất ức chế, enzym -glucosidase bị giảm một phần hoạt tính dẫn đến lượng p-NP sinh ra ít hơn, làm giảm độ hấp thu so với các đối chứng.. - Enzym α-glucosidase: được pha trong dung dịch đệm phosphat pH = 7 đạt nồng độ 0,2 U/mL.. - Mẫu thử: cao chiết được hòa tan trong DMSO 5% đạt các nồng độ 0,5 µg/mL. - Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 100 μL enzym α-glucosidase 0,2 U/mL và bổ sung 50 μL cao chiết ở các nồng độ thử nghiệm, các ống nghiệm được ủ ở 37 o C trong 10 phút. - Mẫu đối chứng acarbose được thực hiện song song và nồng độ khảo sát giống mẫu thử. - Phần trăm enzym α-glucosidase bị ức chế. - Phần trăm lượng enzym -glucosidase bị ức chế được tính theo công thức. - A o : Độ hấp thu trung bình của mẫu trắng A S : Độ hấp thu trung bình của mẫu khảo sát I%: Phần trăm ức chế. - IC 50 được xác định bằng cách vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa giá trị phần trăm ức chế I% theo nồng độ C với phần mềm Excel ta được phương trình logarithm có dạng y = aln(x. - 2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng ung thư vú Khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB đối với tế bào MCF – 7. - Chuẩn bị tế bào và mẫu thử. - Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) được nuôi trong môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamin (2 mL), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 µg/mL), penicillin G (100 UI/mL), streptomycin (100 µg/mL), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37 o C, 5% CO 2.. - Mẫu thử: cao chiết được hòa tan trong DMSO 5% đạt các nồng độ: 100 µg/mL. - Tế bào đơn được cấy trên những vỉ nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 10 4 tế bào/giếng. - Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với mẫu thử ở các nồng độ khác nhau trong 48 giờ.. - Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch acid trichloroacetic 50%. - Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. - Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình.. - Kết quả tính theo công thức Tính giá trị OD = OD 492 – OD 620 (1). - gây độc tế bào theo công thức:. - OD tb : Giá trị OD của giếng có chứa tế bào OD blank : Giá trị OD của giếng blank (không có tế bào). - OD tn : Giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2). - OD C : Giá trị OD của mẫu đối chứng tính từ công thức (1) và (2). - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa. - Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc chất kháng oxy hóa cho một nguyên tử hydrogen để khử gốc tự do DPPH màu tím thành DPPH-H có màu vàng, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm. - Hiệu quả chống oxy hóa của cao chiết từ vỏ và hạt bơ được xác định dựa vào hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH, kết quả thể hiện cụ thể ở Bảng 2.. - Bảng 2: Kết quả khảo sát chống oxy hóa bằng DPPH của cao chiết từ vỏ và hạt bơ Nồng độ mẫu. - Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO%). - Vỏ bơ Hạt bơ Vitamin C. - Các số mang mũ chữ cái khác nhau trong cùng một cột khác nhau có ý nghĩa thống kê với p<0,001 Từ kết quả thể hiện ở Bảng 2 có được phương. - b, từ đó tính được giá trị IC 50 được thể hiện ở Hình 1.. - Hình 1: Đồ thị kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao thử nghiệm. - Kết quả Hình 1 cho thấy các mẫu khảo sát đều có khả năng kháng oxy hóa, trong đó cao chiết từ hạt bơ với ethanol 96% đạt IC 50 cao nhất là 200,97 µg/mL, thấp nhất là mẫu hạt ethanol 70% với IC 50 là 368,55 µg/mL. - Tương tự, ở cao chiết từ vỏ bơ với ethanol 96% có khả năng kháng oxy hóa cao hơn so với khi chiết bằng ethanol 70%, khoảng 1,12 lần.. - 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzym α-glucosidase. - Phần trăm ức chế ức chế enzym α-glucosidase của các cao thử nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.. - Từ Bảng 3 cho thấy khả năng ức chế enzym α- glucosidase tỷ lệ thuận với nồng độ cao thử. - Phương trình thể hiện khả năng ức chế enzym có dạng y. - ax 2 +bx-c, từ đó tính được giá trị IC 50 được thể hiện ở Hình 2.. - Bảng 3: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết từ vỏ và hạt bơ Nồng độ mẫu. - Khả năng ức chế enzym α-glucosidase (I%). - Vỏ bơ Hạt bơ. - Hình 2: Đồ thị kết quả khảo sát khả năng ức chế enzym α-glucosidase. - Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzym α- glucosidase của vỏ và hạt bơ được trình bày ở Hình 2 cho thấy tất cả các mẫu cao chiết đều ức chế enzym α-glucosidase cao hơn khi so với mẫu đối chứng dương acarbose, trong đó các cao chiết từ vỏ thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với cao chiết từ hạt. - 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng ung thư vú. - Bảng 4: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng ung thư vú của cao chiết từ vỏ và hạt bơ Nồng độ mẫu. - Phần trăm gây độc tế bào. - Vỏ bơ Hạt bơ Ethanol Ethanol Kết quả khảo sát hoạt tính kháng ung thư vú ở nồng độ 100 µg/mL của vỏ và hạt bơ được thể hiện ở Bảng 4 cho thấy cao chiết từ hạt có hoạt tính kháng ung thư vú mạnh hơn so với cao chiết từ vỏ, cao nhất là cao hạt chiết với ethanol 96% với phần trăm gây độc tế bào 43,35%, thấp nhất là cao vỏ chiết với. - Quả bơ được xem là nguồn nguyên liệu chứa nhiều chất có hoạt tính kháng oxy hóa như vitamin C, caroten, flavonoid, các chất béo chưa bão hòa.. - (Hurtado, 2014) Hiện nay, trong nước chưa có nhiều nghiên cứu thực nghiệm về hoạt tính sinh học cũng như tác dụng trị bệnh của vỏ và hạt bơ. - Kết quả nghiên cứu của Wang et al. - (2010) cho thấy hạt bơ có khả năng kháng oxy hóa cao nhất khi so với thịt và vỏ. - (2017) kết luận rằng chiết xuất methanol từ vỏ quả kháng oxy hóa cao nhất so với chiết xuất bằng các dung môi khác. - Ngoài ra, nghiên cứu của Cardoso et al. - (2009) chiết xuất methanol, ethyl acetat và chloroform hạt bơ có khả năng kháng lại Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Streptococcus pyos, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Corynebacterium ulcerans, Salmonella typhi, Neisseria gonorrhoea và Candida albicans.. - Về khả năng ức chế tế bào ung thư, theo chương trình tầm soát hợp chất tự nhiên kháng ung thư của viện Ung thư Mỹ: một cao chiết thô được xem là có hoạt tính kháng ung thư in vitro khi có IC 50 20 µg/mL do đó cả vỏ và hạt bơ đều không thể hiện khả năng ở khảo sát. - Tuy nhiên, kết quả cũng cho thấy trong các cao chiết từ vỏ và hạt bơ có chứa các hợp chất tự nhiên cần thiết trong việc ức chế các tế bào ung thư.. - Đề tài khảo sát sơ hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế enzym α-glucosidase của vỏ và hạt bơ Booth 7, các kết quả đã thể hiện được tiềm năng của vỏ và hạt trong các nghiên cứu. - Trong nghiên cứu này, cho thấy cao chiết với dung môi ethanol 96% thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với ethanol 70%, vì đây. - Đặc biệt là polyphenol và flavonoid, là nhóm hợp chất có khả năng kháng oxy hóa mạnh, làm hạ đường huyết cũng như ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư.. - Tổng hợp các kết quả thu được có thể kết luận rằng các cao chiết ethanol từ vỏ và hạt bơ Booth 7 đều có tác dụng kháng oxy hóa, ức chế enzym α-glucosidase trong thực nghiệm in vitro.. - Những kết quả nghiên cứu có thể làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu trong việc điều trị bệnh đái tháo đường cũng như phòng ngừa và ức chế các tế bào ung thư của hạt và vỏ quả bơ.. - Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc có tác dụng chống oxy hóa. - Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược