- Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích tìm ra phương pháp hiệu quả để ly trích enzyme amylase và protease từ tụy gà. - 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu. - 2.2.1 Hiệu quả của các phương pháp ly trích enzyme amylase và protease từ tụy. - Mục đích: tìm phương pháp thích hợp để ly trích enzyme amylase và protease từ tụy gà.. - Sau đó, dung dịch chứa enzyme sẽ được trích bằng ba phương pháp khác nhau.. - Phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa (Phương pháp 2): Hỗn hợp thu được sau khi trích với dung dịch đệm phosphate pH 7 và ly tâm sẽ được kết tủa bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa. - Phương pháp ly trích enzyme bằng cồn 96%. - Xác định hoạt lực protease theo phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003).. - Xác định enzyme trong mẫu bằng phương pháp điện di SDS-PAGE (Harlow và Lane 1988).. - Phân tích điện di SDS-PAGE theo phương pháp của Harlow và Lane (1988). - 2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme amylase và protease. - Hoạt tính enzyme amylase và protease được xác định tương tự thí nghiệm 1 theo phương pháp của Rukhliadeva (1982) và Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường (2003).. - 2.2.3 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên hoạt tính của enzyme amylase và protease. - Hoạt tính enzyme amylase và protease được xác định tương tự theo phương pháp của Rukhliadeva (1982), Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường (2003) (ở mục 2.2.1).. - 2.3 Phương pháp thống kê. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hiệu quả các phương pháp ly trích enzyme amylase và protease từ tụy gà. - Sau khi ly trích enzyme từ tuyến tụy bằng 3 phương pháp khác nhau (bằng dung dịch đệm phosphate pH 7, kết tủa bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4. - Ở phương pháp 2 (kết tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4. - Tiến hành xác định hàm lượng protein và đánh giá hoạt tính của enzyme trích được bằng các phương pháp khác nhau. - phương pháp Anson cải tiến (Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003). - Kết quả cho thấy, hàm lượng protein thu được cao nhất ở phương pháp 3 (kết tủa bằng cồn) là 37,3 mg, hàm lượng protein thu được ở phương pháp 2 (kết tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 ) là 33,5 mg và hàm lượng protein thu được thấp nhất ở phương pháp 1 (trích bằng dung dịch đệm phosphate pH 7) là 24,3 mg. - Bảng 1: Khối lượng mẫu, hàm lượng protein, hoạt tính amylase và protease từ tụy gà qua các phương pháp trích. - Chỉ tiêu Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3 F CV. - Hoạt tính amylase. - Kết quả thử hoạt tính cho thấy rằng, hỗn hợp enzyme trích từ các phương pháp khác nhau có khả năng thủy phân hồ tinh bột và casein. - Hoạt tính enzyme amylase và protease từ tuyến tụy gà của các phương pháp trích có sự khác biệt thống kê ở mức 1% qua phép thứ LSD. - Enzyme trích từ phương pháp 3 (kết tủa bằng cồn) và phương pháp 2 (kết tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 ) cho hiệu quả tương đương nhau với 52,11% đến 52,72% tinh bột được. - Enzyme trích từ phương pháp 1 (trích bằng dung dịch đệm phosphate pH 7) cho hiệu quả thủy phân là 42,76% tinh bột thủy phân trong 1 phút. - Kết quả này thấp hơn so với phương pháp 2 và 3 (Bảng 1). - Hàm lượng protein thu được, hoạt tính của enzyme amylase và protease trong hai phương pháp trích này đều cao hơn so với phương pháp trích bằng dung dịch đệm phosphate pH 7.. - Qua kết quả thử hoạt tính enzyme amylase và protease từ tuyến tụy của gà bằng phương pháp thủy phân hồ tinh bột (Rukhliadeva, 1982) và khảo sát hàm lượng tyrosine sinh ra (Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003), bước đầu cho thấy hỗn hợp trích từ tuyến tụy của gà có sự hiện diện của hai enzyme. - Điều này chứng tỏ rằng hỗn hợp enzyme trích được từ tụy gà bằng 3 phương pháp khác nhau có sự hiện diện của enzyme amylase, chymotrypsin và trypsin.. - Giếng 1: mẫu protein của phương pháp 1. - Giếng 2: Mẫu protein của phương pháp 2. - Giếng 3: Mẫu protein của phương pháp 3 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt. - enzyme amylase và protease từ 3 phương pháp trích được thể hiện ở các Hình 2, 3, 4 và 5.. - 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme amylase. - Hoạt tính enzyme amylase thể hiện cao nhất ở điều kiện nhiệt độ là 50 o C và trong vùng pH 7 đến pH 8 và khác biệt thống kê ý nghĩa ở mức 1% giữa các phương pháp. - Ở điều kiện pH 7, phần trăm tinh bột bị thủy phân trong 1 phút ở 3 phương pháp lần lượt là 57,86% (phương pháp phương pháp 2) và 66,67% (phương pháp 3). - Như vậy, hoạt tính enzyme amylase từ ba phương pháp trích hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ là 50 o C và pH 7 đến pH 8.. - Hình 2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính amylase trích được từ tụy của gà - Phương pháp 1: Ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 rồi đông khô mẫu (a). - Phương pháp 2: Sau khi trích enzyme, mẫu được kết tủa bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa (b. - Phương pháp 3: Sau khi trích enzyme, mẫu được kết tủa bằng cồn 96% (c). - pH phương pháp 1 phương pháp 2 phương pháp 3. - Hình 3: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme amylase của tụy - Phương pháp 1: Ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 rồi đông khô mẫu. - Hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút lần lượt ở 3 phương pháp là 63,56% (phương pháp phương pháp 2) và 73,19% (phương pháp 3) (Hình 3). - 3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme protease. - Sự khác biệt thống kê được ghi nhận ở mức ý nghĩa 1% giữa các phương pháp. - Ở pH 7, hàm lượng tyrosine sinh ra ở 3 phương pháp lần lượt là 0,135 UI (phương pháp 1), 0,186 UI (phương pháp 2) và 0,178 UI (phương pháp 3). - Trong khi đó, ở điều kiện pH 8 hoạt tính enzyme protease tăng hơn so với hoạt tính protease ở pH 7, hàm lượng tyrosine sinh ra ở 3 phương pháp lần lượt là 0,137. - Khi gia tăng nhiệt độ hơn 50 o C và pH cao hơn 8, hoạt tính enzyme protease ở ba phương pháp càng giảm (Hình 4a, b và c). - Hàm lượng tyrosine sinh ra lần lượt ở 3 phương pháp là 0,150 UI (phương pháp 1), 0,204 UI (phương pháp 2) và 0,195 UI (phương pháp 3). - Tóm lại, enzyme protease trích từ tuyến tụy gà của 3 phương pháp trích hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ 50 o C và pH 7,6.. - Hoạt tính protease (tyrosine sinh ra) (UI). - Hoạt tính protease (tyrosine sinh ra)(UI). - Hoạt tính Protease (tyrosine sinh ra)(UI). - Hình 4: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính protease trích được từ tụy gà - Phương pháp 1: Ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 rồi đông khô mẫu (a). - Phương pháp 1: Phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7. - Phương pháp 2: Phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa. - Phương pháp 3: Phương pháp ly trích enzyme bằng cồn 96%. - Như vậy, hỗn hợp enzyme amylase và protease trích từ các phương pháp khác nhau (trích bằng dung dịch đệm phosphate pH 7, kết tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 và kết tủa bằng cồn 96%) của tụy gà cho hoạt động xúc tác cao nhất trong điều kiện nhiệt độ tối ưu đều ở 50 o C và pH lần lượt là 7,5 đối với amylase và 7,6 đối với protease.. - 3.3 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên hoạt tính của enzyme amylase và protease. - 3.3.1 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên hoạt tính của enzyme amylase. - Chất hoạt hóa NaCl ở nồng độ 0,1% đã làm tăng hoạt tính enzyme amylase trích được từ 3 phương pháp. - Hoạt tính amylase trích bằng phương pháp 1 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 59,04%, khi thêm 0,1% NaCl thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút đã tăng lên là 67,20%. - Hoạt tính amylase trích bằng phương pháp 2 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 67,04%, khi thêm 0,1% NaCl thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút đã tăng lên là 77,54%. - Hoạt tính amylase trích bằng phương pháp 3 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 68,21%, khi thêm 0,1% NaCl thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút đã tăng lên là 79,95%.. - Hình 6: Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên hoạt tính enzyme amylase (a) và protease (b) của tụy gà - Phương pháp 1: Phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7. - Phương pháp 2: Phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa - Phương pháp 3: Phương pháp ly trích enzyme bằng cồn 96%. - phương pháp. - Hoạt tính amylase trích bằng phương pháp 1 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 59,04%, khi thêm 0,05% CaCl 2 thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút đã tăng lên là 64,79%. - Hoạt tính amylase trích bằng. - phương pháp 2 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 67,04%, khi thêm 0,05% CaCl 2 thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút đã tăng lên là 74,93%. - Hoạt tính amylase trích bằng phương pháp 3 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 68,21%, khi thêm 0,05% CaCl 2 thì hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút đã tăng lên là 77,40% (Hình 6a).. - 3.3.2 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên hoạt tính của enzyme protease. - Chất hoạt hóa Cysteine ở nồng độ 0,01% đã làm tăng hoạt tính enzyme protease trích được từ 3 phương pháp. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 1 có hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,134 UI, khi thêm 0,01% Cysteine thì hàm lượng tyrosine sinh ra đã tăng lên là 0,163 UI. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 2 có hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,194 UI, khi thêm 0,01%. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 3 có hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,182 UI, khi thêm 0,01% Cysteine thì hàm lượng tyrosine sinh ra đã tăng lên là 0,230 UI.. - CaCl 2 ở nồng độ 0,00001% làm tăng hoạt tính enzyme protease trích được cao nhất ở cả 3 phương pháp. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 1 có hàm lượng tyrosine sinh ra là. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 2 có hàm lượng tinh bột bị thủy phân trong 1 phút là 0,194 UI, khi thêm 0,00001% CaCl 2 thì hàm lượng tyrosine sinh ra đã tăng lên là 0,210 UI. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 3 có hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,182 UI, khi thêm 0,00001% CaCl 2 thì hàm lượng tyrosine sinh ra đã tăng lên là 0,200 UI (Hình 6b). - Phương pháp bảo quản enzyme ảnh hưởng đến khả năng duy trì hoạt tính xúc tác của enzyme. - 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme amylase. - Sau 90 ngày bảo quản ở điều kiện nhiệt độ - 20 o C, hoạt tính enzyme amylase của hỗn hợp enzyme trích được có giảm ở cả 3 phương pháp trích và có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. - Hoạt tính amylase trích bằng phương pháp 1 (dung dịch đệm phosphate pH 7) có hàm lượng tinh bột thủy phân sau 1 phút là 20,53%. - Hoạt tính amaylase trích bằng phương pháp 2 (kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa) có hàm lượng tinh bột thủy phân sau 1 phút là 29,87% so với hoạt tính enzyme amylase lúc đầu là 52,11% lượng tinh bột thủy phân sau 1 phút. - Hoạt tính amaylase trích. - bằng phương pháp 3 (kết tủa bằng cồn 96%) có hàm lượng tinh bột thủy phân là 29,26% sau 1 phút so với hoạt tính enzyme amylase lúc đầu là 52,72%. - Như vậy, hoạt tính. - Hoạt tính enzyme amylase. - Hoạt tính enzyme protease (UI) Phương. - pháp 2 Phương pháp 3. - Sau thời gian 90 ngày bảo quản, hoạt tính của enzyme protease có giảm đi ở cả 3 phương pháp trích. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 1 (trích bằng dung dịch đệm phosphate pH 7) có hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,054 UI so với hoạt tính enzyme protease lúc đầu (0,107 UI). - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 2 (có kết tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4. - Hoạt tính protease trích bằng phương pháp 3 (kết tủa bằng cồn 96%) có hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,077 UI so với hoạt tính enzyme protease lúc đầu với hàm lượng tyrosine sinh ra là 0,140 UI. - Phương pháp trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 và tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 60% bão hòa kết hợp với thẩm tích để. - 0,05% đều làm tăng hoạt tính enzyme amylase.