- NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI TĂNG SINH VI KHUẨN Streptomyces SPP. - including TV1.4, CM2.4 and DH3.4 in m-ISP2 C medium. - Các điều kiện nhiệt độ, pH, độ mặn, các nguồn C và nguồn N được thực hiện trên 3 chủng vi khuẩn Streptomyces spp. - TV1.4, CM2.4 và DH3.4 trong môi trường m-ISP2 C. - Sau đó, nguồn C và N phù hợp đươc chọn để xác định nồng độ tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu. - Tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ quang OD ở bước sóng 600 nm. - Kết quả cho thấy chủng TV1.4 phát triển tốt nhất ở pH 7, nhiệt độ 30℃, độ mặn 10. - Trong 3 chủng nghiên cứu chủng Streptomyces TV1.4 là chủng vi khuẩn tốt nhất.. - Nghiên cứu một số điều kiện nuôi tăng sinh vi khuẩn Streptomyces spp. - Bên cạnh các tác nhân nấm, ký sinh trùng, virus … thì tác nhân vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại lớn đến năng suất ở các mô hình nuôi tôm, cá. - Một số bệnh điển hình do tác nhân là vi khuẩn gây ra như: bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm do Vibrio parahaemolyticus (Lightner et al., 2013), bệnh gan thận mủ trên cá tra do Edwardsiella ictaluri (Crumlish et al., 2002).. - Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces trong tổng số hơn 1.000 loài của xạ khuẩn đã được mô tả. - Giống như hầu hết các xạ khuẩn khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, có bộ gene với tỉ lệ GC% cao. - Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. - Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là giống của xạ khuẩn.. - Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y học.. - Trong quá trình sống xạ khuẩn tiết ra nhiều chất có hoạt tính sinh học cao có khả năng kháng lại các loài vi sinh vật khác nhau bao gồm cả nấm và vi khuẩn (Robati and Mathivanan, 2013). - Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế, do đó đề. - tài “Nghiên cứu một số điều kiện nuôi tăng sinh vi khuẩn Streptomyces spp. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - 2.2 Vật liệu nghiên cứu. - (TV1.4, CM2.4, DH3.4) có hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tốt nhất trong bộ sưu tập vi khuẩn hữu ích tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật hữu ích, Bộ môn Thủy sinh học Ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ đã được chọn để tiến hành thí nghiệm.. - 2.3 Phương pháp nghiên cứu. - Điều chỉnh mật độ tế bào bằng cách pha loãng dung dịch vi khuẩn từ 10 8 còn 10 6 CFU/mL bằng ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý tiệt trùng sau đó xác định giá trị OD 600 để phục vụ cho các thí nghiệm sau.. - 2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ muối. - Mục đích của thí nghiệm nhằm đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ muối (NaCl) lên sự sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. - Ảnh hưởng của nhiệt độ: Dùng micropipette hút 0,1 mL sinh khối tế bào vi khuẩn ở mật độ 10 6 CFU/mL vào ống nghiệm chứa môi trường m-ISP2 tiệt trùng. - Xác định giá trị OD ban đầu của các ống nghiệm ở bước sóng 600 nm (do lượng vi khuẩn bổ sung cấy truyền đã được pha loãng và xác định ngay sau khi bổ sung nên không có sự khác biệt, thí nghiệm cũng được thực hiện lặp lại 3 lần). - Sau 24 giờ, xác định giá trị OD 600 ở các nghiệm thức để đánh giá sự sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn.. - Ảnh hưởng của pH: Môi trường m-ISP2 được sử dụng để xác định ảnh hưởng của pH lên quá trình sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn phân lập bằng dung dịch HCl 1M và NaOH 1M các nghiệm thức được bố trí ở các giá trị pH lần lượt là và 11, mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.. - Dùng micropipette bơm chuyền 0,1 mL sinh khối tế bào đã chuẩn bị trước đó vào ống nghiệm chứa môi trường m-ISP2 tiệt trùng và ghi nhận giá trị OD 600. - Sau đó các nghiệm thức được nuôi trên máy lắc và xác định giá trị OD 600 sau 24 giờ để đánh giá sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn.. - Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl: Các ống nghiệm chứa môi trường m-ISP2 tiệt trùng được điều chỉnh ở các nồng độ muối NaCl, mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.. - Sau khi dùng micropipette chuyển 0,1 mL sinh khối tế bào vào các ống nghiệm, giá trị OD 600 vào thời điểm ban đầu và sau khi nuôi trên máy lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng đã được đo để xác định khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn trong ống nghiệm.. - 2.3.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung các nguồn carbon (C) và nitơ (N) lên sự sinh trưởng. - Ảnh hưởng của các nguồn C: Các nguồn C khác nhau như maltose, sucrose, glucose, starch, glycerol được bổ sung riêng biệt vào môi trường mISP2 với liều lượng 1% (dựa vào báo cáo trước đây của Kiranmayi et al., 2011). - Sau đó dùng micropipette hút 0,1 mL sinh khối tế bào vi khuẩn (10 6 CFU/mL) vào các nghiệm thức. - Sau 24 giờ, mật độ tế bào được đo ở giá trị OD 600 và chọn ra nguồn carbon tốt nhất để đánh giá ảnh hưởng các nồng độ khác nhau lên sinh trưởng của vi khuẩn.. - Ảnh hưởng của các nguồn N: Các nguồn N khác nhau (potassium nitrate, ammonium sulfate, peptone, tryptone, casein) bổ sung vào môi trường ISP2 với tỉ lệ 0,5% (dựa vào báo cáo trước đây của Kiranmayi et al., 2011). - Tiến hành tương tự như phương pháp trên, sau 24 giờ mật độ tế bào được đo ở giá trị OD 600 và chọn ra nguồn N tối ưu để đánh giá ảnh hưởng các nồng độ N khác nhau (0,1%;. - 3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Streptomyces chủng TV1.4, CM2.4 và DH3.4. - 3.1.1 Ảnh hưởng của pH. - nghiên cứu có khả năng phát triển trong khoảng pH từ 4-11, trong đó giá trị OD của chủng TV1.4 đạt cao nhất ở pH là 7 ứng với giá trị OD vào thời điểm thu mẫu lúc 24 giờ cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 1a). - Kết quả ghi nhận được ở pH là 7 có tốc độ tăng trưởng cao nhất với OD khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức ở pH là 8 (p>0,05) nhưng lại cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 1c).. - Trong quá trình thí nghiệm khoảng pH tối ưu của 3 chủng vi khuẩn không có sự khác biệt đáng kể, thích hợp với môi trường trung tính hoặc hơi kiềm có pH trong khoảng từ 7 đến 8. - Kết quả trong nghiên cứu này tương tự với nghiên cứu trước đây của Cabell et al. - (2003), vi khuẩn Streptomyces vẫn duy trì sự phát triển ở pH 6,5-8,0. - Chủng DH3.4 có tốc độ tăng trưởng thấp đáng kể so với 2 chủng vi khuẩn còn lại có thể do môi trường m-ISP2 dùng để nuôi vi khuẩn không phù hợp với chủng DH3.4 vì theo nghiên cứu của Mitra et al. - Hình 1: Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn (a) TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - Các giá trị trung bình có các ký tự mũ a, b, c khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).. - 3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ. - Trong 3 chủng nghiên cứu, chủng vi khuẩn TV1.4 có mật độ cao nhất khi nuôi tăng sinh ở 30℃. - Bên cạnh đó chủng vi khuẩn CM2.4 có tốc độ tăng trưởng cao nhất khi nuôi tăng sinh ở nhiệt độ 40℃ với giá trị OD cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức nhiệt độ còn lại (p<0,05) (Hình 2b).. - Tương tự, chủng vi khuẩn DH3.4 cũng có tốc độ tăng trưởng cao nhất khi nuôi ở nhiệt độ 35℃ đạt. - giá trị OD không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 2 nghiệm thức ở nhiệt độ 30 o C và 40 o C (p>0,05) nhưng lại cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức nhiệt độ còn lại (p<0,05) (Hình 2c). - Các nghiên cứu trước đây nhận định rằng hầu hết Streptomyces sp. - Do vậy nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu trước đây. - (2004) đã nghiên cứu ba loài Streptomyces thermonitrificans, S. - thermoflavus cho thấy vi khuẩn tăng trưởng đạt sinh khối cao ở nhiệt độ nuôi cấy từ 40-45℃. - Một nghiên cứu khác cũng xác định xạ khuẩn Streptomyces parvulus HNR3X4 sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường nuôi cấy với nhiệt độ phát triển từ 15-45℃ và pH từ 4 – 9 (Phan Thị Hồng Thảo và ctv., 2016).. - Nhiệt độ. - Hình 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn (a) TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - 3.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối (NaCL) Sau 24 giờ nuôi cấy, chủng TV1.4 có giá trị OD 600 dao động từ 0,804 đến 0,870. - Trong đó, nghiệm thức có nồng độ muối 1% có tốc độ tăng trưởng cao nhất với giá trị OD không có ý nghĩa so với nghiệm thức 0 % ở cùng thời điểm (p>0,05) nhưng lại cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức nồng độ muối còn lại (Hình 3a). - Tương tự với chủng TV1.4, chủng CM2.4 cũng có tốc độ tăng trưởng cao nhất ở nghiệm thức có nồng độ muối 1% với giá trị OD 600. - Chủng DH3.4 đạt giá trị OD dao động từ 1,212 đến 1,235 trong đó giá trị cao nhất ở nghiệm thức có. - nồng độ muối 1% với giá trị OD khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức có độ muối 2% (p>0,05) nhưng lại cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức độ muối còn lại (Hình 3c). - Các chủng xạ khuẩn thuộc nghiên cứu này chịu nồng độ muối khoảng 0-10‰ nên có thể xếp vào nhóm chịu muối thấp. - Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu đã công bố của Nguyễn Thị Minh Hằng và Đỗ Văn Bút (2013) khi cho rằng các chủng xạ khuẩn có thể sinh trưởng tốt ở độ mặn 0-20‰.. - Hình 3: Ảnh hưởng của độ mặn lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn (a) TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - 3.1.4 Ảnh hưởng của nguồn C. - Khi tiến hành nuôi xạ khuẩn trong môi trường có bổ sung riêng biệt các nguồn carbon khác nhau (maltose, saccarose, glucose, starch, glycerol), cho thấy cả 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt, nguồn starch là nguồn C phù hợp nhất cho cả 3 chủng vi khuẩn Streptomyces khảo sát.. - Trong đó chủng TV1.4 phát triển đạt giá trị cao nhất. - sau 24 giờ thu mẫu với giá trị trung bình OD 600. - =1,275 cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 4a) cũng ở nghiệm thức này chủng CM2.4 cũng có tốc độ tăng trưởng cao nhất với giá trị OD cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 4b). - Tương tự như 2 chủng trên, giá trị OD của chủng DH3.4 ở nghiệm thức sử dụng starch có tốc độ tăng trưởng cao nhất với giá trị OD và cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Hình 4c).. - Hình 4: Ảnh hưởng của nguồn C lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn (a) TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - Sau khi xác định được nhiệt độ, pH và độ mặn thích hợp cho từng chủng vi khuẩn, vi khuẩn được nuôi trong điều kiện thích hợp nhất có bổ sung nguồn starch. - Kết quả cho thấy đối với chủng TV1.4 ở nồng độ 2% và 3% starch mật độ vi khuẩn đạt cao nhất với giá trị OD 600 lần lượt là 1,299 đến 1,330 cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p<0,05) (Hình 5a). - Đối với chủng CM2.4, nghiệm thức có nồng độ starch 1%. - Chủng DH3.4 cũng có mật độ vi khuẩn cao nhất ở nghiệm thức starch 1%. - Với kết quả nguồn C tốt nhất là starch phù hợp với báo cáo của một số nhà nghiên cứu cho rằng, các polysacarit như starch và glycerol thường là nguồn carbon tốt nhất vì chúng hỗ trợ tốc độ tăng trưởng cho vi khuẩn (Jonsbu et al., 2002).. - Hình 5: Ảnh hưởng của nồng độ starch lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn (a) TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - 3.1.5 Ảnh hưởng của nguồn N. - <0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 6a).. - Tuy nhiên peptone là nguồn nguyên liệu được chọn trong thí nghiệm tiếp theo (Hình 6b), do mật độ vi khuẩn khi nuôi bằng peptone cao hơn tryptone.. - Tương tự như khuynh hướng này chủng DH3.4 vi khuẩn có mật độ cao nhất (OD khi được nuôi bằng peptone (Hình 6c).. - Hình 6: Ảnh hưởng của nguồn N lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn (a) TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - Sau khi đã xác định được nguồn N thích hợp lên từng chủng vi khuẩn, 3 chủng vi khuẩn được chọn đã nuôi trong nguồn N phù hợp. - Ở nồng độ tryptone 2% vi khuẩn tăng sinh tốt nhất (OD cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 7a). - Đối với chủng CM2.4 peptone được chọn là nguồn N tốt nhất cho sự tăng sinh của vi khuẩn này. - Nghiệm thức có nồng độ peptone 1% vi khuẩn tăng sinh cao nhất (OD cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 7b). - Ở nghiệm thức có nồng độ peptone 2% vi khuẩn có tốc độ tăng sinh (OD cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại (Hình 7c).. - Một nghiên cứu cho thấy loại và nồng độ nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất của vi khuẩn Streptomyces (Rafieenia, 2013). - Nghiên cứu cũng cho thấy môi trường lên men polysaccharides thông thường là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất chất kháng sinh.. - Do vậy chọn lựa nguồn carbohydrates thích hợp sẽ giúp tăng quá trình tăng trưởng của vi khuẩn Streptomyces nhằm thu được tối đa các hoạt tính của vi khuẩn trong nghiên cứu này. - Ngoài ra nguồn nitơ đơn giản và vô cơ thường làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn Streptomyces (Young et al., 1985).. - Hình 7: Ảnh hưởng của nguồn N lên tăng trưởng của các chủng vi khuẩn TV1.4, (b) CM2.4 và (c) DH3.4. - Chủng TV1.4 phát triển tốt nhất ở pH 7, nhiệt độ 30℃, độ mặn 10. - Trong 3 chủng nghiên cứu chủng Streptomyces TV1.4 tốt nhất.. - Tiếp tục bố trí các thí nghiệm ở quy mô lớn hơn để đánh giá ảnh hưởng của các tác động môi trường đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn.