- NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHÂN SINH HỌC BÓN CHO ĐẬU NÀNH: CHẤT MANG THÍCH HỢP CHO SỰ SỐNG. - SÓT CỦA VI KHUẨN NỐT RỄ VÀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS SPP. - Chủng vi khuẩn nốt rễ Sinorhizobium fredii [VN064] và vi khuẩn hòa tan lân, tổng hợp IAA Pseudomonas spp. - Từ khóa: Vi khuẩn nốt rễ, vi khuẩn hòa tan lân, chất mang, đậu nành, sự sống sót. - Sự gia tăng sản lượng cũng như năng suất cây trồng tương quan thuận với lượng phân bón hóa học sử dụng và chính sự lạm dụng phân hóa học và thuốc bảo vệ thực vật làm cho môi trường ngày càng ô nhiểm và nông dân cũng bị ảnh hưởng (Kumar et al., 2001). - Sự hiệu qủa của vi khuẩn cố định đạm đã giúp giải quyết phần nào lượng phân đạm hóa học (Chabot et al., 1996). - Ngoài ra, những vi sinh vật hòa tan lân khó tan đã được nhiều nhà khoa học phân lập và sản xuất phân lân sinh học để tận dụng nguồn lân khó tan có sẵn trong đất và giảm bớt lượng lân hoá học như super lân… (Katnelzson et al., 1962. - Whitelaw et al., 1999). - Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy những vi sinh vật cố định đạm và hòa tan lân sẽ gia tăng tác dụng nếu như có sự hỗ trợ của những vi khuẩn vùng rễ kích thích sự tăng trưởng cây trồng (Plant Growth Promoting Rhizobacteria =PGPR) ngay cả trên cây một và hai lá mầm (Shimshick và Hebert, 1979. - dòng vi khuẩn này giúp cho lông hút và rễ của những cây trồng phát triển nhanh chóng (Molla et al., 2001). - Lippmann et al., 1995. - Sergeeva et al., 2002), chính vì vậy mà nhiều nhà khoa học phối hợp nhiều nhóm vi sinh vật để phát huy tác dụng của tất cả các nhóm vi sinh vật có ích (Dashti et al . - Loại phân bón này đã phát huy tác dụng trên cây bắp lai (Chabot et al., 1996), đậu nành (Molla et al., 2001), đậu pea (Kumar et al., 2001), lúa mạch (Belomov et al., 1995), cải ăn lá (Antoun et al., 1998), trên lúa gạo và lúa mì (Rasul et al., 1998). - Vì vậy, người ta tìm kiếm những vật liệu thích hợp để giải quyết được những khó khăn trên trong đó sử dụng than bùn như là một chất mang cho vi khuẩn sống sót và phát triển là thích hợp nhất thế nhưng than bùn có những bất lợi sau:. - Thành phần lý hóa tính của than bùn thay đổi theo nguồn gốc thành lập và không ổn định.. - Giá thành cao ở những nuớc không có nguồn than bùn mà phải nhập nội nên giá thành phân chủng cao.. - Khi khử trùng nhiệt ướt, than bùn có thể hình thành một số độc tố không mong muốn ảnh hửơng đế sự sống sót của vi khuẩn.. - Để giải quyết những yếu tố bất lợi trên, người ta sử dụng những vật liệu khác để thay thế than bùn như than đá, vermiculite (Paau, 1989) hay mụn xơ dừa (coir- dust)(Faizah et al.,1980), mùn mía, bentonite, kaolinite, rơm rạ, phân hữu cơ, cùi bắp…. - Sparrow và Ham, 1983) hay người ta có thể pha trộn các vật liệu này với nhau để tạo ra chất mang tốt nhất cho sự sống sót của vi khuẩn.. - Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu chất mang (carrier) thích hợp, rẻ tiền, dễ tìm…. - giúp cho vi khuẩn sống sót tốt trong 6 tháng trong điều kiện nhiệt độ phòng và sản phẩm có chất lượng đạt yêu cầu của phân chủng sinh học (TCVN 6166-1996 và TCVN 6167-1996 ban hành năm 2001 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).. - 2.1.1 Vi khuẩn. - Vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) dòng VN064 phân lập từ nốt rễ đậu nành trồng ở thị xã Cao Lãnh, Đồng Tháp (Nguyễn Ngọc Đáng, 2004).. - Vi khuẩn Pseudomonas spp. - dòng P14 phân lập từ đất vùng rễ cây So Đũa ở Đồng Tháp, dòng vi khuẩn này hòa tan lân cao và tổng hợp IAA [indole-3- acetic acid] khá (Lê Kim Sáu, 2005).. - 2.1.2 Than bùn và bã bùn mía. - Than bùn có nguồn gốc từ các vĩa than bùn ở vùng Maren, huyện Thạnh Hóa, tỉnh Long An và bã bùn mía là các chất thải từ nhà máy đường Vị Thanh, tỉnh Hậu Giang với thành phần được trình bày trong bảng 1.. - Vi khuẩn nốt rễ dòng VN064 được nuôi trong 150 ml môi trường Yeast Extract Mannitol (Somasagaran và Hoben, 1995) trong các bình tam giác 250 mL đặt trên máy lắc xoay vùng trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng và đạt mật số >. - 10 9 tế bào/ml, sẳn sàng để trộn vào chất mang để sản xuất phân sinh học 50%. - dòng P14 (Lê Kim Sáu, 2005), vi khuẩn này nuôi trong môi trường King B trong 2 ngày (cấp 1) trên máy lắc ngang để mật số đạt 10 9 tế bào/ml, sau đó được nhân trong môi trường đơn giản (cấp 2) để ủ trong chất mang, đồng thời vi khuẩn này được nuôi cấp 3 với môi trường sucrose (10. - apatit (1%)(Whitelaw et al., 1999) để sản xuất cấp 3 dùng để tưới cho cây đậu như là nguồn cung cấp IAA trong điều kiện lên men bình thường ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, mật số đạt >. - Bảng 1: Thành phần lý hóa tính của than bùn và bã bùn mía. - Đặc tính Than bùn (a) Bã bùn mía (b). - Mục đích tạo ra chất mang thích hợp cho vi khuẩn có thể sống sót và phát triển tốt trong 6 tháng và để có chất mang tốt (có pH= 6,5-7,0. - tỉ lệ C/N một chất mang được tổ hợp từ các vật liệu dễ tìm, rẻ tiền, dễ xử lý tiệt trùng như sau:. - Giai đoạn 1: Chọn chất mang (chất độn) để nuôi vi khuẩn. - Than bùn hay mùn mía có thành phần lý hóa tính được trình bày trong bảng 1, được xử lý cho khô bằng cách phơi trong mát hay sấy ở nhiệt độ thấp (xem như nghiệm thức không khử trùng). - Thí nghiệm có 3 nghiệm thức: Than bùn, than bùn+mùn mía, than bùn+phân heo+mùn mía (bảng 2) và chất mang không khử trùng nhiệt ướt và khử trùng và theo thời gian và 6 tháng. - Dòng vi khuẩn nốt rễ (dòng VN064) và dòng vi khuẩn Pseudomonas spp. - (dòng P14) được nuôi trong môi trường thích hợp để mật số đạt 10 9 tế bào/ml (như mô tả ở phần trên), chất mang được khử trùng nhiệt ướt ở 121 o C trong 30 phút và kéo dài 3 đợt. - Dịch vi khuẩn được trộn đều vào chất mang ở 50% ẩm độ, sau đó được ủ ở nhiệt độ phòng (28 – 30 o C), lấy mẫu để đếm sống vi khuẩn trong môi trường thích hợp (YEM cho vi khuẩn nốt rễ và môi trường King B hay Pseudomonas Isolation Agar [Difco]) lúc khởi đầu và định kỳ một tháng/lần để xác định loại chất mang thích hợp cho vi khuẩn sống sót và phát triển trong một thời gian nhất định.. - Dưỡng chất Than bùn. - Than bùn +Mùn mía. - Than bùn+Mùn mía+phân heo. - Than bùn 95 50 50. - Mùn mía 0 45 25. - Giai đoạn 2: Xử lý chất mang để kéo dài sự sống sót của vi khuẩn. - Chất mang được chọn lọc trong giai đoạn 1 được tiến hành xử lý với hợp chất CMC và Alginate để nâng cao chất lượng chất mang, cụ thể như sau:. - Dịch vi khuẩn lên men trong môi trường thích hợp (như trong giai đoạn 1) đạt mật số 10 9 tế bào/ml, bổ sung với CMC với 3 nồng độ 0,1 và 2% và Alginate với 3 nồng độ 0, 1 và 2%. - Sau đó trộn với chất mang đã đưọc chọn lọc trong giai đoạn 1, tiến hành đếm sống vi khuẩn trong môi trường thích hợp lúc khởi đầu và định kỳ 1 tháng/lần, mục tiêu là kéo dài chất lượng sản phẩm ít nhất là 6 tháng trong điều kiện tồn trữ nhiệt độ phòng (28 - 30 o C).. - Khảo sát sự sống sót của 2 loại vi khuẩn trong 3 loại chất mang là: than bùn (Kiên Giang), than bùn+phân heo (hoai)+mùn mía và hổn hợp than bùn+mùn mía với điều kiện không khử trùng và khử trùng nhiệt ứơt.. - Kết quả cho thấy mật số vi khuẩn nốt rễ [VKNR] trong 2 loại chất mang là than bùn+phân heo+mùn mía và than bùn+mùn mía trong điều kiện không và khử trùng nhiệt ứơt (hình 6) sau 6 tháng trữ trong nhiệt độ phòng. - trong hình 7 cho thấy chất mang hổn hợp gồm than bùn+phân heo+mùn mía không khử trùng có mật số VKNR ổn định và ở mức cao trong suốt từ tháng thứ 2 đến hết tháng thứ 6, kế đến là chất mang gồm hổn hợp than bùn+mùn mía không khử trùng và chất mang gồm. - Than bùn. - Than bùn+phân heo+mùm mía Than bùn+Mùn mía. - Than bùn+phân heo+mùn mía Than bùn+mùn mía. - hổn hợp than bùn+phân heo+mùn mía khử trùng có mật số VKNR ổn định và khá cao (log 10 /g chất mang >. - TB= than bùn, TB+PH+MM= than bùn+phân heo+mùn mía, TB+MM= than bùn+mùn mía. - 1: có khử trùng. - (Những cột có số theo sau cùng một chữ không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức độ 1%) Hình 1: Mật số vi khuẩn nốt rễ (log 10 /g chất mang) trong 3 loại chất mang trong điều kiện. - không và khử trùng nhiệt ướt. - chất mang không khử trùng. - chất mang khử trùng nhiệt ướt. - Hình 2: Mật số vi khuẩn nốt rễ (log 10 /g chất mang) trong 3 loại chất mang (không và có khử trùng nhiệt ướt) trong 6 tháng. - (Những cột có số theo sau cùng một chữ không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức độ 1%) Hình 3: Mật số vi khuẩn Pseudomonas spp. - (log 10 /g chất mang) trong 3 loại chất mang. - Hình 4: Mật số vi khuẩn Pseudomonas spp. - Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn chất mang than bùn+mùn mía không khử trùng để nghiên cứu ảnh hưởng chất dính (CMC [carboxyl methyl-cellulose]. - và Alginate) đến sự sống sót của 2 loại vi khuẩn trên vì hai lọai chất mang này dể kiếm và hiệu quả cao, giá thành thấp vì không khử trùng (đở tốn năng lượng).. - Kết quả từ hình 5 cho thấy chất mang bổ sung 1% hay 2% CMC có mật số VKNR cao nhất trong 6 tháng trử trong đó không có sự khác biệt ý nghĩa về giữa 2 nồng độ 1% và 2% CMC đối với sự sống sót của VKNR trong 6 tháng (hình 5), tính không ổn định của Alginate cũng như nồng độ và giá thành của Alginate đã ảnh hưởng đến khâu xét chọn chất dính.. - Trong hình 6 và hình 7 cho thấy kết quả sự sống sót của vi khuẩn Pseudomonas spp. - tương tự như trường hợp VKNR và với 1% CMC phù hợp cho sự sống sót của vi khuẩn này trong 6 tháng.. - Như vậy, qua 2 thí nghiệm trên chúng tôi chọn thành phần chất mang là THAN BÙN+MÙN MÍA cùng với 1% CMC để sản xuất phân sinh học sau này.. - (Những cột có số theo sau cùng một chữ không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức độ 1%) Hình 5: Mật số vi khuẩn nốt rễ (log 10 /g chất mang) trong chất mang than bùn+mùn mía với. - Hình 6: Mật số vi khuẩn nốt rễ (log 10 /g chất mang) trong chất mang than bùn+mùn mía với 2 loại chất dính (CMC và Alginat) với 3 nồng độ. - (Những cột có số theo sau cùng một chữ không khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức độ 1%) Hình 7: Mật số vi khuẩn Pseudomonas spp. - (log 10 /g chất mang) trong chất mang than. - bùn+mùn mía với 2 loại chất dính (CMC và Alginat) với 3 nồng độ. - Hình 8: Mật số vi khuẩn Pseudomonas spp. - Từ lâu người ta sử dụng than bùn như là một chất mang giúp cho vi khuẩn sống sót và phát triển thích hợp nhất thế nhưng than bùn có những bất lợi như thành phần lý hóa tính của than bùn thay đổi theo nguồn gốc thành lập và không ổn định, giá thành cao ở những nuớc không có nguồn than bùn mà phải nhập nội nên giá thành phân chủng cao và khi khử trùng nhiệt ướt, than bùn có thể hình thành một số độc tố không mong muốn ảnh hưởng đế sự sống sót của vi khuẩn. - Để giải quyết những yếu tố bất lợi trên, người ta sử dụng những vật liệu khác để thay thế than bùn như than đá, vermiculite (Paau, 1989) hay mụn xơ dừa (coir-dust)(Faizah et al. - Sparrow và Ham, 1983) hay người ta có thể pha trộn các vật liệu này với nhau để tạo ra chất mang tốt nhất cho sự sống sót của vi khuẩn. - Tuy nhiên, để kéo dài sự sống sót của vi khuẩn trong chất mang trong một thời gian, người ta sử dụng các dạng cao phân tử (polymers) tự nhiên hay tổng hợp (Dommergues et al., 1979. - Jung et al. - (1982) như gum, xanthan, CMC (carboxyl methyl cellulose), PVP (polyvinyl pyrrolidol) hay polyethylenglycerol (PEG), và gum arabic giúp vi khuẩn sống sót tốt (Rodriguez- Navarro et al. - (1992) hay theo Dernandin và Freire (2000) hổn hợp gum và PVP có thể kéo dài sự sống sót của vi khuẩn nốt rễ lên đến 8 tháng sau khi tồn trữ và một trong những tiến bộ trong sự duy trì sự sống sót và khả năng tạo nốt rễ của các dòng vi khuẩn nốt rễ được nuôi trong môi trường lỏng bổ sung 2% PVP (Tran Yen Thao et al., 2002).. - Chất mang thích hợp cho phân sinh học đa chủng bón cho đậu nành với thành phần là 50% than bùn + 50% mùn mía cùng với 1% CMC làm chất dính để ép thành viên để bón (rải) cho đậu nành sạ lan hay rải thành hàng hoặc dạng rời để trộn với tro trấu lấp lổ đậu.. - Đa dạng sinh học vi khuẩn nốt rễ phân lập từ nốt rễ Đậu nành ở phía đông sông Hậu bằng phương pháp PCR-ARDRA 16S-23S IGS. - Malik et al (eds