- Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. - Abstract: Nghiên cứu sử dụng một số phương pháp như: phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELIS, phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh chuột, kỹ thuật Western Blot … Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp). - Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng này với protein đó trên vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis.. - Kháng thể. - Vi khuẩn than Content. - Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng thành công các sản phẩm của hệ miễn dịch vào các lĩnh vực trong cuộc sống như trong Y học điều trị bệnh ung thư, chẩn đoán lâm sàng phát hiện bệnh, phát hiện các tác nhân vi sinh vật, các loại độc chất, ma túy, khoa học hình sự, phát hiện ô nhiễm môi trường… với nhiều phương pháp như ELISA, Western Blot, Dot Blot, miễn dịch huỳnh quang, sắc ký miễn dịch dòng bên (que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch)…Các kỹ thuật trên đều sử dụng đến sản phẩm của hệ miễn dịch là kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng.. - Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B.. - Tạo kháng thể đa dòng kháng lại 1 protein đặc trưng trên vỏ bảo tử vi khuẩn Bacillus anthracis (protein này được sản xuất theo con đường tái tổ hợp). - Đây là bước đầu tiên trên con đường nghiên cứu sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất kháng thể đơn dòng tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ -Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật-Bộ Công An.. - Chủng vi khuẩn B. - Kháng thể: Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Alkaline Phosphatase antibody produced in goat, Anti-Mouse IgG (Fab specific)–Peroxidase antibody produced in goat.. - Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch. - Trước khi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp nhằm tránh khả năng làm giảm hiệu suất tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein quan tâm theo phương pháp điện di SDS-PEGE 12.5%.. - Hình 1: Kết quả điện di protein BclA tái tổ hợp trên gel 12.5%. - Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch. - Chúng tôi tiến hành cộng hợp huyết thanh của chuột với dung dịch hạt vàng nano có kích thước 40nm, OD 15 để kiểm tra xem sự có mặt của kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp cũng như dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. - anthracis theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch.. - Trên các que thử số 1 và số 2, tại các vị trí T 1 và T 2 , tương ứng với vị trí được trải protein BclA tái tổ hợp và dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than, không thấy xuất hiện vạch mầu đỏ hồng. - Điều đó cho thấy trong huyêt thanh của lô chuột thử nghiệm không chứa kháng thể kháng protein BclA dạng tái tổ hợp cũng như dạng tự nhiên. - anthracis, từ đó cho phép chúng tôi tiến hành những bước nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo kháng thể đa dòng kháng lại protein tái tổ hợp BclA.. - Hình 2: Kết quả kiểm tra mẫu huyết thanh 1: T 1 được trải với mẫu protein BclA 2: T 2 được trải với dịch phá vỏ bào tử. - Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột.. - Nhằm đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với BclA tự nhiên trên vỏ bào tử B. - anthracis, chúng tôi tiến hành gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng BclA tái tổ hợp với quy trình như sau: kháng nguyên BclA sau khi được tinh sạch bằng cột Talon (Niken) được hòa với đệm PBS và tá dược Freund’s (toàn phần và không toàn phần) rồi tiêm dưới da bụng chuột. - Việc gây kháng thể ở chuột được thực hiện với hai lần tiêm, trong đó lần tiêm đầu tiên chúng tôi sử dụng tá dược toàn phần, lần tiêm nhắc lại chúng tôi sử dụng với tá dược không toàn phần. - Sau lần tiêm thứ hai 2 tuần chúng tôi tiến hành thu máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể có trong huyết thanh bằng kỹ thuật lai miễn dịch hoặc theo phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch.. - Hình 3: Biểu đồ Elisa về quá trình gây đáp ứng miễn dịch. - Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành cộng hợp dung dịch huyết thanh của chuột theo các tuần theo dõi khả năng đáp ứng miễn dịch với dung dịch hạt nano vàng có kích thước hạt là 40nm với OD 15, nhằm kiểm tra khả năng sinh kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trong quá trình gây đáp ứng miễn dịch.. - Bằng phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch (Hinh 4) cho thấy kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch và cộng hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein BclA tái tổ hợp với nồng độ 0.3mg/ml và mật độ trải lên màng là 0,1μl/1mm.. - Hình 4: Que thử dạng sắc ký miễn dịch kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng BclA. - Vị trí C: Trải kháng thể đa dòng Goat anti mouse Vị trí T: Trải protein BclA tái tổ hợp. - Kết quả trên cho thấy, trong dịch huyết thanh của chuột thấy có xuất hiện kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp được biểu hiện bằng sự hiện vạch mầu hồng tại vị trí T. - Tại vị trí C chúng tôi trải kháng thể đa dòng của dê kháng lại IgG của chuột (Goat anti mouse), nhằm mục đích kiểm tra sự hoạt động của dung dịch kháng thể đa dòng kháng protein BclA cộng hợp hạt vàng nano 40nm. - Tại que thử thứ 2 vào tuần thứ 2 của quá trình gây đáp ứng miễn dịch đã có sự chững lại về lượng kháng thể sinh ra, bằng chứng. - Ở que thử số 4, qua kết quả chỉ thị màu tại vị trí T, chúng tôi thấy rằng lượng kháng thể có tăng lên nhưng không nhiều. - Do đó, chúng tôi tiến hành thu máu lô chuột gây đáp ứng miễn dịch, tiến hành thu huyết thanh chuột và tinh sạch kháng thể để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.. - Ngoài ra, chúng tôi tiến hành thay màng cộng hợp có chứa kháng thể kháng protein BclA tái tổ hợp với hạt vàng nano 40nm OD 15 vào que thử multi các loại thuốc gây nghiện là THC, Morphine để kiểm tra đánh giá khả năng phản ứng chéo và khả năng phong bế (block) các hạt vàng của dung dịch kháng thể kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano. - Hình 5: Que thử miễn dịch kiểm tra khả năng phản ứng chéo và block hạt vàng. - Kết quả (Hình 5) thu được cho phép kết luận rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA không phản ứng chéo với các protein khác (ở đây là BSA – Bovine serum albumin). - Mặt khác, trên que thử tại hai vạch T 1 và T 2 không xuất hiện vạch màu hồng cũng đồng nghĩa chứng tỏ trong dung dịch kháng thể đa dòng kháng BclA cộng hợp hạt vàng nano hạt vàng đã được block hoàn toàn các liên kết làm cho hạt vàng không còn khả năng phản ứng với các protein nào khác.. - Từ đó cho phép chúng tôi kết luận rằng, việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công. - Tinh sạch kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp. - Tuy đã thu được huyết thanh có chứa chủ yếu là kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với Protein BclA tái tổ hợp, nhưng thực tế trong huyết thanh vẫn còn rất nhiều các protein không mong muốn khác. - Vì vậy, chúng tôi tiến hành sử dụng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP (hãng GE Healthcare) để loại các protein không mong muốn, nhằm thu được kháng thể IgG kháng Protein BclA tinh sạch.. - Sau đó, tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đặc hiệu với cột protein G-Sepharose) bằng đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7. - Các phân đoạn rửa chiết kháng thể nhanh chóng được trung hòa về pH 7.0 bằng bằng cách bổ sung 200 μl thể tích đệm Tris-HCl 1 M, pH 9.0 trên 1ml phân đoạn, nhằm tránh cho kháng thể bị biến tính và tiến hành xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford khi đo độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. - Để khẳng định độ tinh sạch của kháng thể thu được, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra phân đoạn protein gắn đặc hiệu thu được từ cột protein G-Sepharose bằng kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE 12.5%. - rửa chiết bằng đệm Glycine-HCl 0.1 M, pH 2.7) có hai băng protein duy nhất với khối lượng phân tử lần lượt là 53kDa và 25kDa, tương ứng với khối lượng của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kháng thể IgG. - Kết quả này chứng tỏ kháng thể thu được là tinh sạch.. - Hình 7: Kết quả điện di tinh sạch kháng thể đa dòng kháng protein BclA. - 1: Marker BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder 2: Phân đoạn tinh sạch kháng thể đa dòng. - Chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể vừa tinh sạch bằng phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford. - Kết quả nồng độ kháng thể chúng tôi thu được là 1.3mg/ml.. - Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ thuật tạo que thử dạng sắc kỹ miễn dịch. - Với mục đích tạo được kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng nhận biết được protein BclA tự nhiên có trên vỏ bào tử B. - anthracis , chúng tôi tiến hành phá vỏ bào tử B.. - anthracis bằng cách cho bào tử vi khuẩn B. - Tiến hành ly tâm dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. - Hình 8: Kết quả thử nghiệm trên que thử miễn dịch với dịch phá vỏ bào tử.. - T2: Kết quả hiện màu với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than. - Từ kết quả trên cho chúng tôi thấy rằng, bước đầu chúng tôi đã tạo thành công kháng thể đa dòng bắt được kháng nguyên tự nhiên của vỏ bào tử vi khuẩn B. - anthracis bằng cách tạo kháng nguyên trên vỏ bào tử (BclA) theo con đường tái tổ hợp. - Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn (T2). - tiến hành kiểm tra khả năng phát hiện của kháng thể đa dòng với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi khuẩn B. - Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng phƣơng pháp Western blot.. - Sau khi có kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của kháng thể đa dòng với dung dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than tự nhiên trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng phản ứng kháng nguyên- kháng thể giữa kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp với dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than (BclA tự nhiên) bằng phương pháp western blot. - Đây là một bước quan trọng để có thể khẳng định được quá trình gây tạo kháng thể đa dòng từ kháng nguyên tái tổ hợp có khả năng bắt cặp được với kháng nguyên tự nhiên từ vỏ bào tử vi khuẩn B. - Hình 9: Kết quả lai chuyển thấm kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể 1: Huyết thanh trước khi gây đáp ứng miễn dịch. - 2: Dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn B. - 3: Protein BclA tái tổ hợp. - Điều này chứng tỏ kháng thể có trong huyết thanh chuột trước khi được gây đáp ứng miễn dịch không có khả năng nhận ra hay phản ứng chéo với protein BclA tái tổ hợp. - Mặt khác, kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây đáp ứng miễn dịch ở độ pha loãng 1000 lần có khả năng nhận biết đặc hiệu với băng chứa BclA tái tổ hợp có kích thước vào khoảng 35kDa (giếng 3). - Ngoài ra, kết quả còn cho thấy kháng thể đa dòng có khả năng nhận biết một băng tương tự của dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than có kích thước vào khoảng 70kDa (giếng 2) tương ứng với kháng nguyên BclA tự nhiên . - Thứ nhất: Việc gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột bạch đã thành công.. - Thứ hai: Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng bắt cặp với kháng nguyên trên vỏ bào tử vi khuẩn than.. - Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn B. - subtilis trên que thử dạng sắc ký miễn dịch.. - Như chúng ta đã biết, thành phần protein BclA có trong vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn là B. - thuringiensis (hình 5) và chủng vi khuẩn không có protein BclA là B.. - Do đó sau khi đã tinh sạch kháng thể kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Hitrap protein G- Sepharose HP, chúng tôi tiến hành kiểm tra sơ bộ khả năng bắt cặp kháng nguyên kháng thể của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của cả ba chủng vi khuẩn B.. - Chúng tôi tiến hành phá vỏ bào từ vi khuẩn B. - vỏ bào tử vi khuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch nổi. - Tiến hành thử nghiệm trên que thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch cho kết quả (Hình 10) như mong đợi.. - Hình 10: Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn B. - 1: Dịch phá vỏ bào tử B. - subtilis 2: Dịch phá vỏ bào tử B. - 3: Dịch phá vỏ bào tử B. - thuringiensis 4: Dịch phá vỏ bào tử B. - Trên que thử với dịch phá vỏ bào tử của vi khuẩn B. - subtilis, cho kết quả âm tính điều đó chứng tỏ rằng kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp không phản ứng chéo với các protein trên vỏ bào tử của B. - Điều đó phù hợp với những khảo sát rằng, vỏ bào tử vi khuẩn B. - subtilis không có chứa thành phần protein BclA trên vỏ bảo tử. - thuringiensis, chúng tôi đều thu được kết quả phản ứng tốt giữa kháng thể đa dòng với các dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn này. - Trên que thử kết quả phản ứng cho một màu đỏ nâu, điều đó một lần nữa có thể khẳng định chúng tôi đã chế tạo thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có khả năng phản ứng lại được với protein BclA tự nhiên. - Trên cơ sở đó, từ việc sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA trên vỏ của bào tử vi khuẩn than, chúng ta có thể tiến hành những nghiên cứu tiếp theo để sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng lại BclA trên vỏ bào tử của vi khuẩn Bacillus anthracis. - Bằng phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch, đã sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp.. - Đã tinh sạch được kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp bằng hệ thống cột sắc ký ái lực HiTrap™ Protein G HP.. - Kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp có phản ứng với protein BclA tự nhiên có mặt trong dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than.. - Chúng tôi đã thành công trong việc tạo ra kháng thể đa dòng kháng lại protein BclA tái tổ hợp và kháng thể này có phản ứng tích cực với protein BclA tự nhiên. - Do đó, trong hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành sử dụng protein BclA tái tổ hợp làm kháng nguyên để tạo kháng thể đơn dòng kháng lại BclA của vỏ bào tử vi khuẩn B