Nghiên cứu thủy phân protein cám gạo bằng enzyme sử dụng trong nuôi cấy Bacillus subtilis

- NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN CÁM GẠO BẰNG ENZYME SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY Bacillus subtilis.
- Bacillus subtilis, cám gạo, pepton, protein, thủy phân Keywords:.
- Cám gạo là một trong những nguồn phụ phẩm từ công nghiệp chế biến gạo với hàm lượng protein cao.
- Để nâng cao giá trị của nguồn phụ phẩm này, nghiên cứu thủy phân protein từ cám gạo của giống lúa IR 50404 và thử nghiệm trên nuôi cấy vi sinh vật đã được thực hiện.
- nồng độ enzyme sử dụng (50-150 U) và thời gian thủy phân (60-240 phút) khi sử dụng papain và neutrase trên cơ chất protein được chiết tách từ cám gạo.
- Sau đó, dịch thủy phân được sấy phun ở 170 o C làm môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis (thời gian ủ 72 giờ, 4 giờ thu mẫu một lần).
- Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme papain và neutrase lần lượt có hoạt động thủy phân hiệu quả nhất ở nồng độ cơ chất 2,5% và 2%, nồng độ enzyme sử dụng 100 U và 125 U trong cùng thời gian 180 phút cho hiệu suất thủy phân đạt 20,97% và 14,66%.
- Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch thủy phân protein cám gạo bằng enzyme papain và neutrase đều có đặc tính dinh dưỡng tương đương pepton thương mại khi được sử dụng là môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis (mật số 1x10 8 (cfu/mL) và 8,6x10 7 (cfu/mL), cùng đạt cực đại sau 24 giờ nuôi ủ).
- Protein từ cám gạo có thể sử dụng như thành phần dinh dưỡng có giá trị cho vi khuẩn..
- Nghiên cứu thủy phân protein cám gạo bằng enzyme sử dụng trong nuôi cấy Bacillus subtilis.
- Cám gạo là một trong những đồng sản phẩm nhiều nhất được sản xuất trong ngành công nghiệp chế biến lúa gạo, chiếm 10-12% tổng trọng lượng (Chiou et al., 2013).
- Cám gạo có hàm lượng protein khoảng 12-20% có thể sử dụng như một nguồn protein tiềm năng với chất lượng cao, giá rẻ cho nguồn thực phẩm mới (Saunders, 1990)..
- Protein cám gạo được biết đến với khả năng ít gây dị ứng có thể hữu ích trong các khẩu phần thức ăn cho trẻ sơ sinh và có tác dụng chống ung thư (Betschart et al., 1977.
- Các sản phẩm thủy phân protein cám gạo là một nguồn giàu các peptide có hoạt tính sinh học (Boonla et al., 2015).
- Tuy nhiên, các nghiên cứu về các điều kiện của enzyme sử dụng đối với cơ chất protein cám gạo để đạt hiệu quả thủy phân tốt nhất và ảnh hưởng của sản phẩm thủy phân lên vi sinh vật vẫn chưa được quan tâm.
- Trong số các phương pháp thủy phân protein, phương pháp hóa học (sử dụng acid hoặc kiềm cao, ở nhiệt độ cao) cho thời gian thủy phân nhanh nhưng hầu hết các vitamin và một số acid amine bị phá hủy, sản phẩm có hàm lượng muối đáng kể, chi phí năng lượng và thiết bị cao do phải chịu nhiệt và chống acid ăn mòn, mức độ độc hại cao và gây ô nhiễm môi trường, có thể sinh ra độc tố (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)..
- Nguồn enzyme từ các chế phẩm enzyme thương mại đã được sử dụng để thay thế cho các tác nhân hóa học và hiệu suất tối đa đạt 70%, nhiều loại enzyme được kết hợp với nhau để tăng hiệu suất thủy phân như: protease, cellulase, amylase.
- thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amine, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn.
- thủy phân protein trong quá trình tinh chế DNA từ tế bào động và thực vật (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)..
- Bên cạnh đó, sản phẩm thủy phân sẽ được sử dụng để làm môi trường thử nghiệm cho sự sinh trưởng của vi sinh vật.
- Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt động thủy phân của enzyme papain và neutrase khi cơ chất là protein cám gạo.
- Đồng thời, đánh giá sự ảnh hưởng của dịch thuỷ phân protein cám gạo bằng hai enzyme này lên quá trình phát triển của Bacillus subtilis..
- 2.1 Thu nhận protein từ cám gạo.
- Quá trình thu nhận protein cám gạo được thực hiện qua 3 bước:.
- Loại dầu cám gạo: cám gạo được hòa trong dung môi n-hexan (w/v=1:3).
- Cám gạo đã tách béo được xay, sàng lọc, đóng gói và bảo quản ở 5C để.
- Thu nhận protein cám gạo: cám gạo đã tách béo được hòa tan trong nước cất (w/v=1:6) và điều chỉnh đến pH 10 bằng NaOH 1 N, ủ lắc ở 200 rpm trong 3 giờ.
- sau đó chỉnh về pH 7 bằng HCl 1 N, bổ sung enzyme α-amylase với tỷ lệ E/S (enzyme/cơ chất là dịch cám gạo đã tách béo.
- Xác định các chỉ số dinh dưỡng của cám gạo trước và sau tách béo, protein cám gạo:.
- 2.2 Ảnh hưởng của enzyme papain và neutrase đến hiệu quả thủy phân protein cám gạo.
- Xác định nồng độ cơ chất và thời gian thủy phân thích hợp của enzyme: protein cám gạo trong 10 mL dung dịch đệm phosphate ở pH tối ưu của từng enzyme (papain pH = 7,5.
- Tiến hành thủy phân theo thời gian từ 60-360 phút trên từng enzyme ở nhiệt độ tối ưu tương ứng..
- Xác định hoạt tính enzyme sử dụng và thời gian thủy phân hiệu quả: nồng độ cơ chất tối ưu của từng enzyme ở thí nghiệm trước được sử dụng trong thí nghiệm này.
- Protein cám gạo được pha trộn với 10 ml dung dịch đệm phosphate ở pH tối ưu của từng enzyme (papain pH = 7,5.
- Các enzyme và mẫu được ủ với dung dịch đệm phosphate có pH và nhiệt độ thích hợp đối với từng enzyme trong thời gian 30 phút, sau đó cho dung dịch enzyme vào dung dịch cơ chất, thời gian thủy phân được xác lập, khuấy đảo mẫu trong suốt quá trình thủy phân để các enzyme hoạt động tốt hơn.
- Các bình mẫu được thủy phân theo thời gian từ 60-300 phút với mỗi enzyme ở nhiệt độ tối ưu tương ứng.
- 2.3 Đánh giá sự phát triển Bacillus subtilis trên dịch thủy phân.
- Chuẩn bị môi trường thử nghiệm: dịch trích ly protein cám gạo, các dịch thủy phân được sấy phun ở 170C, tốc độ bơm 16 vòng/phút.
- subtilis trên dịch thủy phân: Cho vào mỗi bình một lượng môi trường thử nghiệm sao cho hàm lượng đạm hòa tan là như nhau giữa các nghiệm thức, sau đó thêm vào 27 mL nước cất, khuấy đều dung dịch và điều chỉnh về pH = 7 (sử dụng dung dịch NaOH 1 N và HCl 1 N) trước khi tiệt trùng ở nhiệt độ 121C, 15 phút.
- Kết quả phân tích một số thành phần hóa học trong cám gạo trước và sau tách béo được trình bày.
- trong Bảng 1 đã cho thấy tách béo cám gạo là một bước cần thiết trước trích ly và thủy phân protein cám gạo..
- Bảng 1: Một số thành phần hóa học cơ bản của cám gạo và protein cám gạo.
- Cám nguyên liệu Cám gạo tách béo Cơ chất protein cám.
- Điều kiện thủy phân protein cám gạo thích hợp bằng enzyme papain và neutrase.
- Ghi chú: gPro là lượng (gam) cơ chất protein trích ly từ cám gạo.
- Kết quả từ Bảng 2 cho thấy, hoạt tính xúc tác của neutrase trên cơ chất protein cám gạo thấp hơn papain (vì K m neutrase >.
- Hằng số tốc độ phản ứng (K m ) của enzyme neutrase thủy phân protein xương heo được báo cáo bởi Pagán et al., 2013 ở tỉ lệ E/S (1,5 g/100 g) là 0,036 gPro, và K m của enzyme neutrase trên cơ chất thịt dè cá tra là 0,241 gPro, điều này chứng tỏ rằng khả năng thủy phân của enzyme neutrase đối với cơ chất protein cám gạo rất thấp và thấp hơn cả trên cơ chất protein xương heo.
- Như vậy, quá trình khảo sát động học của 2 enzyme cho thấy, với cơ chất protein cám gạo thì cả hai enzyme đều có khả năng thủy phân thấp và papain thủy phân hiệu quả hơn neutrase..
- Xác định nồng độ cơ chất và thời gian thủy phân thích hợp của enzyme papain và enzyme neutrase.
- Hình 1: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo thời gian thủy phân của enzyme papain ở các nồng độ cơ chất khác nhau.
- Từ kết quả Hình 1 cho thấy, tốc độ phản ứng thủy phân của enzyme papain tăng nhanh trong giai đoạn đầu.
- 2,25 và 2,5%) và thời gian thủy phân (60.
- 210 và 240 phút) đến hàm lượng tyrosin sinh ra cho kết quả giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa (p<0,05), enzyme papain thủy phân hiệu quả nhất ở nồng độ.
- Một nghiên cứu trên cơ chất thịt dè cá tra cũng cho kết quả thời gian thủy phân thích hợp nhất ở 240 phút nhưng nồng độ cơ chất tối ưu thấp hơn nhiều và hàm lượng tyrosin sinh ra cao hơn gấp 2 lần ở các thời điểm phân tích đạt 0,727 gTyr/100 gPro (Tạ Hùng Cường, 2014)..
- Hình 2: Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng tyrosin theo thời gian thủy phân của enzyme neutrase ở các nồng độ cơ chất khác nhau.
- Kết quả thể hiện qua Hình 2 cho thấy hàm lượng tyrosin sinh ra (gTyr/100 gPro) trong quá trình thủy phân bằng enzyme neutrase tăng đều theo thời gian từ 0÷240 phút.
- và thời gian thủy phân và 360 phút) đến hàm lượng tyrosin sinh ra thì enzyme neutrase thủy phân hiệu quả nhất ở nồng độ cơ chất 2% và thời gian 240 phút với hàm lượng tyrosin sinh ra đạt 0,241 gTyr/100 gPro thấp hơn so với nghiên cứu trên cơ chất thịt dè cá tra là 0,358 gTyr/100 gPro (Tạ Hùng Cường, 2014)..
- Từ các kết quả phân tích cho thấy ở các nồng độ cơ chất khác nhau thì hàm lượng tyrosin sinh ra khác nhau, lúc đầu khi tăng nồng độ cơ chất và thời gian thủy phân thì hàm lượng tyrosin sinh ra cũng tăng tuyến tính, nhưng khi nồng độ cơ chất càng cao thì hàm lượng tyrosin sinh ra theo thời gian tăng càng chậm đạt đến giai đoạn ổn định và sau đó có xu hướng giảm.
- mỗi enzyme có nồng độ cơ chất tối thích khác nhau, thời gian thủy phân khác nhau trong điều kiện xác định.
- Trên cơ chất protein cám gạo enzyme papain cho hiệu quả thủy phân tốt hơn neutrase với hàm lượng tyrosin sinh ra là 0,434 cao hơn 0,241 (gTyr/100 gPro).
- Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự với một báo cáo sử dụng enzyme flavourzyme ở điều kiện thủy phân tối ưu sau 6 giờ cho hàm lượng tyrosin sinh ra ở cơ chất thịt cá và protein thịt cá lần lượt là 0,39 và 0,40 gTyr/100 gPro (Nilsang et al., 2005)..
- Xác định nồng độ enzyme và thời gian thủy phân protein cám gạo bằng enzyme papain và neutrase.
- Hiệu suất thủy phân của enzyme có thể được tính bằng hàm lượng tyrosin tại thời điểm bất kỳ do enzyme thủy phân sinh ra trên hàm lượng tyrosin thủy phân hoàn toàn trong cùng một khối lượng cơ chất (Benjakul and Morrisey, 1997)..
- Hàm lượng tyrosin tổng được xác định bằng cách thủy phân hoàn toàn 1 gPro bằng acid HCl 6 N ở 100C trong 36 giờ (Xian et al., 2008) cho kết quả là 3,282 gTyr/100gPro cao hơn 2,335 gTyr/100gPro trên cơ chất thịt dè, phụ phẩm cá tra (Tạ Hùng Cường, 2015) và một nghiên cứu khác trên phụ phẩm cá nước ngọt 2,4 gTyr/100gPro (Ghaly et al., 2013)..
- Hình 3: Hiệu suất thủy phân enzyme papain theo nồng độ enzyme và thời gian Hình 3 cho thấy hiệu suất thủy phân của enzyme.
- papain tăng dần theo thời gian thủy phân ở các nồng độ enzyme từ 50-100 U, đạt hiệu suất cao nhất ở nồng độ 100 U và khi tăng nồng độ lên đến 150 U thì hiệu suất giảm nhanh và thấp hơn cả 50 U tại thời điểm 300 phút.
- Điều này phù hợp với khảo sát động học của enzyme do papain có hằng số động học trên cơ chất protein cám gạo lớn nên vận tốc phản ứng chậm.
- Thời gian thủy phân càng dài thì hiệu suất thủy phân càng giảm hay hàm lượng tyrosin sinh ra tăng càng chậm, do các sản phẩm tạo thành ngày càng nhiều, nồng độ chất tan tăng lên.
- quá cao làm giảm độ linh động của enzyme trong môi trường gây ức chế hoạt động thủy phân của enzyme (Tạ Hùng Cường, 2014)..
- Kết quả kiểm định LSD về ảnh hưởng của nồng độ enzyme và 150 U) và thời gian và 300 phút) đến hiệu suất thủy phân của papain cho thấy ở nồng độ enzyme 100 U và thời gian 180 phút có hiệu suất thủy phân cao nhất đạt 20,97%.
- hiệu suất thủy phân tăng theo thời gian và có sự khác biệt ý nghĩa (p<0,05) giữa các nghiệm thức 60, 120 và 180 phút.
- Trên cơ chất là protein cám gạo enzyme papain cho hiệu suất thủy phân thấp hơn nhiều so với nghiên cứu trên cơ chất thịt dè đạt 41,803% (Tạ Hùng Cường, 2014) và phụ phẩm cá tra với 46,32% ở 240 phút (Lâm Văn Mềnh, 2016)..
- Hình 4: Hiệu suất thủy phân enzyme neutrase theo nồng độ enzyme và thời gian Dựa vào Hình 4, hiệu suất thủy phân của enzyme.
- neutrase tăng dần theo thời gian thủy phân ở các nồng độ enzyme từ 50-125 U, đạt hiệu suất cao nhất ở nồng độ 125 U và hiệu suất giảm nhanh gần bằng ở 50 U tại thời điểm 300 phút khi tăng nồng độ đến 150 U.
- 0,9% sau 120 phút điều này phù hợp với khảo sát động học của enzyme do neutrase có hằng số động học trên cơ chất protein cám gạo lớn và lớn hơn cả papain nên vận tốc phản ứng chậm và thấp hơn papain.
- Kết quả kiểm định LSD về ảnh hưởng nồng độ enzyme và thời gian đến hiệu suất thủy phân cho thấy ở nồng độ enzyme 125 U và thời gian 180 phút.
- neutrase có hiệu suất thủy phân cao nhất đạt 14,66%..
- Trên cơ chất là protein cám gạo enzyme neutrase cho hiệu suất thủy phân thấp hơn nhiều so với nghiên cứu trên cơ chất thịt dè ở 240 phút đạt 17,87% (Tạ Hùng Cường, 2014) và cao hơn trên cơ.
- 3.1 Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis trên dịch thủy phân.
- Protein cám gạo .
- Đạm thủy phân bằng papain .
- Đạm thủy phân bằng neutrase .
- subtilis ở các môi trường nuôi cấy là đạm peptone, đạm thủy phân bằng papain và bằng neutrase thì không khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) nhưng đều khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức protein cám gạo.
- Sự khác biệt này là do đạm amin trong protein cám là các acid amine, còn hầu hết trong sản phẩm đạm thủy phân và peptone là các peptide mạch ngắn ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sử dụng của vi khuẩn.
- Mật số vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường đạm thủy phân bằng papain đã đạt tới giá trị cực đại khi kết thúc giai đoạn ủ 24 giờ (1x10 8 (cfu/mL.
- Đối với môi trường nuôi cấy đạm thủy phân bằng neutrase được quan sát thấy mật số cũng đạt cực đại sau 24 giờ (8,6 x10 7 (cfu/mL.
- Ở môi trường protein cám gạo có mật số vi khuẩn tăng khá đều và ít, bình quân mỗi 4 giờ tăng khoảng 2-3x10 6 cfu/mL và cao nhất khi ở 40 giờ nuôi cấy, ổn định đến 52 giờ và suy giảm còn 2,3x10 7 (cfu/mL) ở 72 giờ.
- Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Taskin and Kurbanoglu, 2007 trên bột peptone lông gà thủy phân (2,69), peptone từ cá (2,61), tryptone peptone (2,37), và theo nghiên cứu của Gerhardt, 1981 protease peptone (2,05) với tốc độ tăng sinh khối được theo dõi bằng cách đo mật độ quang học tại 600 nm (OD 600 nm).
- Môi trường đạm thủy phân bằng papain cho mật số B.
- Tiếp theo là môi trường đạm thủy phân bằng neutrase có mật số cao.
- Trong tất cả các nghiệm thức thì protein cám gạo có mật số vi khuẩn thấp nhất và sự sinh trưởng của vi khuẩn cũng khá chậm sau 40 giờ mới đạt được mật số 4,7x10 7 (cfu/mL)..
- Kết quả cho thấy, môi trường đạm thủy phân bằng papain có đặc tính dinh dưỡng cao khẳng định khả năng có thể thay thế trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn là khả thi (đạt cực đại 1x10 8 (cfu/mL) sau 24 giờ nuôi cấy).
- Đạm thủy phân bằng neutrase cho kết quả tương tự về mặt dinh dưỡng nhưng thấp hơn so với sản phẩm thủy phân bằng papain (đạt cực đại 8,6x10 7 (cfu/mL) sau 24 giờ).
- Protein cám gạo cũng có giá trị dinh dưỡng tuy nhiên không cao bằng các môi trường đạm thủy phân và peptone (sau 46 giờ đạt 4,7x10 7 (cfu/mL))..
- Trên cơ chất protein cám gạo, kết quả nghiên cứu cho thấy papain có hiệu quả thủy phân tốt hơn neutrase, ở pH và nhiệt độ tối ưu enzyme papain thủy phân tốt nhất ở nồng độ cơ chất 2,5%, nồng độ enzyme sử dụng 100 U trong thời gian 180 phút đạt hiệu suất 20,97% và enzyme neutrase thủy phân tốt nhất ở nồng độ cơ chất 2,0%, nồng độ enzyme sử dụng 125 U trong thời gian 180 phút đạt hiệu suất 14,66%.
- Khi sử dụng protein cám gạo thủy phân bởi papain và neutrase cho thời gian nuôi cấy rút ngắn đáng kể (mật số 1x108 (cfu/mL) và 8,6x107 (cfu/mL), cùng đạt cực đại chỉ sau 24 giờ nuôi ủ), mật độ vi sinh vật cao hơn 1,9 và 1,6 lần so với môi trường peptone thương mại ở cùng thời điểm 24 giờ..
- Protein cám gạo cũng có ý nghĩa về mặt giá trị dinh dưỡng tuy không cao bằng các môi trường đạm thủy phân và peptone (đạt cực đại sau 46 giờ với mật số 4,7x10 7 cfu/mL)..
- Nghiên cứu khả năng thủy phân protein từ đầu và xương cá tra bằng bromelain, papain và neutrase.
- Nghiên cứu thu nhận protein từ cám gạo.
- Nghiên cứu chế biến bột protein thủy phân từ thịt dè cá tra