NGHIÊN CỨU TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

- NGHIÊN CỨU TRÍCH LY ENZYME PROTEASE TỪ THỊT ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon).
- Nhiệt độ, pH, protease, thịt đầu tôm sú, thời gian, trích ly, trữ đông, tỷ lệ dung môi.
- Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của thời gian trữ đông của thịt đầu tôm sú đến quá trình trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú (Penaeus monodon) và các điều kiện tối ưu trích ly enzyme protease.
- Kết quả khảo sát cho thấy, việc trữ đông nguyên liệu đến 8 tuần vẫn giúp duy trì ổn định hoạt tính enzyme protease có trong thịt đầu tôm.
- Dịch chiết protease kiềm thu được từ thịt đầu tôm sú có tổng hoạt tính cao nhất là 13,48 U/g CKNL (chất khô nguyên liệu) với tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 4 (w/v).
- thời gian trích ly 40 phút..
- Tỷ lệ đầu tôm được loại bỏ trong quá trình chế biến khoảng 34%.
- Việc nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm trong thời gian gần đây là một hướng mới nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn đầu tôm phụ phẩm (Trung et al., 2003).
- Tuy nhiên, việc sản xuất chitosan đòi hỏi phải loại bỏ lượng thịt trong đầu tôm (chiếm đến 15,25% khối lượng đầu tôm và 5,5% so với nguyên liệu tôm sú tươi), tạo ảnh.
- Chính vì thế, yêu cầu đặt ra là nghiên cứu biện pháp sử dụng nguồn nguyên liệu giàu protein và enzyme nhằm nâng cao giá trị thương phẩm của tôm sú, đồng thời làm giảm tác động ô nhiễm môi trường do quá trình xử lý đầu tôm là vấn đề có tính cấp thiết..
- Thịt đầu tôm sú (đã được tách sẵn phần thịt ở vị trí ngay đỉnh đầu, bỏ phần chân hàm, chân ngực, râu và vỏ đầu ngực, chùy) được cung cấp từ ấp Bưng Cốc, xã Phú Mỹ, huyện Thạnh Trị, tỉnh Sóc Trăng.
- Thịt đầu tôm sú sau khi đưa về phòng thí nghiệm được rửa sơ bộ với tỷ lệ đầu tôm và nước là 1: 2 (w/v), loại bỏ các chất bẩn và phần râu, chân tôm còn sót lại (phần nổi trên mặt nước).
- Hóa chất sử dụng để trích ly enzyme (các dung dịch đệm): tris HCl, Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , Glycine, NaOH (Merck, Đức)..
- Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme:.
- 2.3 Phương pháp trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú.
- Thịt đầu tôm sú đông lạnh được phối trộn với dung môi theo tỷ lệ khảo sát.
- Tiếp theo, hỗn hợp được nghiền bằng máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3000 rpm) trong thời gian 3 phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu..
- Tiến hành xác định hoạt tính protease trong.
- 2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease.
- Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 30°C và pH = 7,6..
- 2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.5.1 Phương pháp xác định thành phần cơ bản của thịt đầu tôm sú.
- Nguyên liệu thịt đầu tôm ở mỗi đợt thu mẫu (lấy ngẫu nhiên 200 g/mẫu, ít nhất 3 mẫu trong một đợt khảo sát) được xay nhuyễn và sử dụng để tiến hành phân tích các thành phần cơ bản như: độ ẩm, protein tổng số, lipid, pH..
- 2.5.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian trữ đông thịt đầu tôm sú đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease.
- Thí nghiệm tiến hành nhằm mục tiêu đánh giá hiệu quả trữ đông đến sự ổn định hoạt tính protease trong thịt đầu tôm sú.
- Thịt đầu tôm sú sau xử lý sơ bộ và cân theo khối lượng mẫu khảo sát trước khi bảo quản lạnh đông ở -18C.
- Ứng với từng thời gian bảo quản (1 đến 8 tuần), trích ly và xác định hoạt tính enzyme protease.
- Việc trích ly protease được thực hiện theo phương pháp được trình bày ở mục 2.4.
- Ở thí nghiệm này, sử dụng dung môi trích ly là nước cất với tỷ lệ mẫu và dung môi là 1: 2 (w/v, g/mL), tiến hành trích ly ở nhiệt độ phòng (30 ± 2C) trong thời gian 20 phút (Nguyễn Lệ Hà, 2011).
- 2.5.3 Thí nghiệm 2: Xác định tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly protease.
- Thí nghiệm tiến hành khảo sát với nhân tố tỷ lệ mẫu và dung môi dùng để trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú.
- Tiến hành trích ly enzyme protease như mục 2.4, thịt đầu tôm sú xay nhuyễn được sử dụng để trích ly protease bằng nước cất ở nhiệt độ cố định (nhiệt độ phòng, khoảng 32.
- Chọn lựa tỷ lệ mẫu và dung môi phù hợp dựa trên hoạt tính protease đạt cao nhất..
- 2.5.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của sự thay đổi pH dung môi đến hiệu quả trích ly protease từ thịt đầu tôm sú.
- Thí nghiệm khảo sát với mục đích xác định được khoảng pH thích hợp (điều chỉnh bằng dung dịch đệm khác nhau) giúp thu được protease từ mẫu thịt đầu tôm nguyên liệu có hoạt tính cao nhất..
- Quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm được thực hiện tương tự như thí nghiệm 2.
- Thay thế dung môi trích ly là nước cất bằng các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau, bao gồm dung dịch đệm phosphate (pH 7), đệm Tris-HCl (pH 8, 9) và đệm Glycine - NaOH (pH 10 ÷ 12).
- Dựa trên kết quả thống kê sự thay đổi hoạt tính protease, chọn lựa pH dung môi sử dụng để trích ly protease từ thịt đầu tôm sú..
- 2.5.5 Thí nghiệm 4: Xác định tương tác của nhiệt độ và thời gian ủ đến hiệu quả trích ly protease.
- Thí nghiệm được thực hiện dựa trên quy trình trích ly ở mục 3.2.3 và các thông số thích hợp đã được lựa chọn từ thí nghiệm 2, 3).
- Tổng hoạt tính protease có trong dịch chiết enzyme (U/g CKTĐT).
- X 1 : nhiệt độ trích ly (C) và X 2 : thời gian trích ly, phút.
- Vẽ đồ thị bề mặt đáp ứng và xác định điều kiện nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu..
- Bảng 1: Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú TT.
- ủ (C) Thời gian ủ (phút).
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần cơ bản thịt đầu tôm sú Việc xác định thành phần hóa lý cơ bản và hoạt tính protease ban đầu của thịt tôm sú là việc cần thiết và cần phải quan tâm đầu tiên trước khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.
- Bảng 2: Thành phần hóa lý cơ bản của thịt đầu tôm sú.
- Hoạt tính protease (U/g CKNL.
- Hoạt tính protease (U/g.
- Là kết quả của quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú ban đầu trước khi cho vào bảo quản lạnh đông trong điều kiện: tỷ lệ mẫu: dung môi là 1: 2.
- dung môi ngâm trích ly được sử dụng là nước cất hai lần (pH = 7).
- Kết quả khảo sát cho thấy, hàm lượng đạm tổng số trong thịt đầu tôm khá cao .
- Trong quá trình sản xuất thịt đầu tôm sú là phụ phẩm – thường được xem phế liệu của quá trình xử lý đầu tôm chuẩn bị cho việc chế biến chitosan.
- Nói cách khác, thịt đầu tôm chính là phụ phẩm của phụ phẩm, trong thời gian dài, phần lớn các cơ sở sản xuất chitosan đều chỉ nghiên cứu tìm giải pháp phân hủy thịt đầu tôm để thu nhận vỏ tôm (Ngô Thị Hoài Dương et al., 2008).
- Trong thời gian gần đây, một số nhà máy chế biến phụ phẩm thủy sản đã tiến hành tách riêng thịt đầu tôm để bán cho các cơ sở chế biến thức ăn gia súc, tuy nhiên phương thức bảo quản chưa được kiểm soát và thời gian chờ tách thịt đầu tôm ở một số cơ sở còn kéo dài, điều này dẫn đến sự biến đổi chất lượng thịt đầu tôm và là nguyên nhân pH tăng cao (7,87).
- Áp dụng biện pháp trích ly protease theo các thông số từ khảo sát của Nguyễn Lệ Hà (2011), tuy nhiên sử dụng dung môi là nước cất, hoạt tính protease có trong thịt đầu tôm khoảng 1,19 U/g CKNL..
- 3.2 Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến hoạt tính protease từ thịt đầu tôm sú.
- Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 3 cho thấy hoạt tính enzyme protease từ thịt đầu tôm sú khá ổn định trong suốt thời gian trữ đông gần như không khác biệt, dao động từ 0,782 đến 0,752 U/g..
- Kết quả thí nghiệm cho thấy tính khả thi của việc trữ đông thịt đầu tôm sú đối với việc ổn định hoạt tính protease, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong quá trình trích ly enzyme.
- thấy việc nghiên cứu tìm ra điều kiện trích ly enzyme phù hợp, trước hết là tỷ lệ dung môi và nguyên liệu, tính chất của dung môi là các điều kiện cơ bản cần được quan tâm..
- Bảng 3: Ảnh hưởng của việc bảo quản lạnh đông nguyên liệu đến sự ổn định hoạt tính protease từ thịt đầu tôm sú.
- Hoạt tính protease (U/g).
- 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi đến quá trình trích ly enzyme protease từ thịt đầu tôm sú.
- Ở khảo sát này, thịt đầu tôm sú đã xay nhuyễn được sử dụng để trích ly protease bằng nước cất ở nhiệt độ cố định (nhiệt độ phòng, khoảng 30°C) trong thời gian cố định 20 phút, tỷ lệ mẫu và nước cất (w/v) được thay đổi lần lượt từ 1: 1 đến 1: 6..
- Tác động của tỷ lệ dung môi bổ sung vào nguyên liệu đến hiệu quả của quá trình trích ly – thể hiện qua sự thay đổi hoạt tính protease tương ứng được thể hiện ở Hình 1..
- Theo lý thuyết, khi tăng thể tích dung môi so với khối lượng mẫu thì quá trình trích ly enzyme từ nguyên liệu vào dung môi sẽ trở nên dễ dàng hơn..
- Ở tỷ lệ 1: 1, hoạt tính thu được tương ứng là 0,139 (U/g).
- Tuy nhiên, việc thay đổi tỷ lệ mẫu và nước cất trong quá trình trích ly cũng làm giá trị pH dịch trích thay đổi, ảnh hưởng đến độ hòa tan và khả năng khuếch tán của các protein từ thịt đầu tôm sú vào dịch trích.
- Khi thay đổi tỷ lệ mẫu và dung môi lớn hơn tỷ lệ 1: 4 (w/v) thì tổng hoạt tính protease của dịch trích ly sẽ giảm cụ thể:.
- ở tỷ lệ trích ly 1: 5 là 1,297 (U/g) và 1: 6 là 0,732 (U/g).
- Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 4 (w/v) được sử dụng để nghiên cứu các điều kiện trích ly tiếp theo..
- Hình 1: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly đến hoạt tính protease từ thịt đầu tôm sú.
- 3.4 Ảnh hưởng của pH dung môi đến hiệu quả trích ly protease.
- Chính vì vậy, nghiên cứu tiến hành trích ly protease từ thịt đầu tôm sú, sử dụng các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau như sau: dung dịch đệm phosphate (pH 7,0 và 8,0), đệm Glycine-NaOH (pH .
- 4 (w/v) dựa trên kết quả thí nghiệm 1, nhiệt độ và thời gian trích ly được cố định lần lượt là 30°C và 20 phút.
- Bảng 4: Ảnh hưởng của pH dung môi đến hiệu quả trích ly protease.
- pH của dung môi Hoạt tính protease (U/g) Nước cất (đối chứng) 1,921 c ± 0,062.
- được sẽ thay đổi khi sử dụng các dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau để trích ly enzyme.
- Dịch trích ly từ thịt đầu tôm sú có tổng hoạt tính protease cao nhất (3,823 U/g CKNL) khi sử dụng dung dịch đệm có giá trị pH = 9,0.
- Khi tăng pH từ 7,0 đến 9,0, tổng hoạt tính protease của dịch trích ly enzyme thu được tăng từ 2,426 đến 3,823 U/g CKNL, tức tăng khoảng 1,6 lần.
- Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng giá trị pH từ 9,0 đến 11,0 thì tổng hoạt tính protease của dịch trích ly enzyme thu được sẽ giảm khoảng 1,18 lần.
- So với mẫu đối chứng sử dụng dung môi là nước cất, khi sử dụng dung dịch đệm pH 9,0 để trích ly enzyme từ thịt đầu tôm sú thì tổng hoạt tính protease thu được cao hơn khoảng 2 lần..
- 3.5 Ảnh hưởng của tương tác nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận protease từ thịt đầu tôm sú.
- Ma trận qui hoạch thực nghiệm quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú được trình bày ở Bảng 5..
- 0,05, chứng tỏ độ tin cậy của kết quả đo đạc giá trị protease tương ứng với các mẫu trích ly ở các lần khảo sát khác nhau..
- Đồng thời, tất cả giá trị P của các thừa số khảo sát đều nhỏ hơn 0,05 và giá trị F lớn hơn 10 đã chứng tỏ các nhân tố khảo sát đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú..
- X 2 :Thời gian+ block .
- Từ đồ thị tổng quát biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease thu nhận ở Hình 2 cho thấy, hai nhân tố này thật sự có sự ảnh hưởng đồng thời đến quá trình trích ly enzyme protease.
- Với nhiệt độ trích ly thấp và thời gian ly trích ngắn cho hiệu quả ly trích kém, trong khi đó, nếu nâng nhiệt độ ly trích lên mức cao nhất và thời gian ly trích kéo dài, protease bị mất hoạt tính..
- Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở Hình 3 một lần nữa khẳng định cả hai yếu tố pH và nhiệt độ đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease từ thịt đầu tôm sú..
- Hình 2: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt và thời gian đến hoạt tính của enzyme protease.
- Hình 3: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của enzyme protease được chiết tách.
- Phương trình thực nghiệm tối ưu hóa hai nhân tố thời gian và nhiệt độ đối với quá trình trích ly thông qua kết quả thí nghiệm có được là:.
- Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly enzyme từ thịt đầu tôm sú khi giải phương trình hồi qui (1).
- Dựa theo kết quả thu được trên Hình 3, điều kiện thích hợp để chiết enzyme từ thịt đầu tôm sú cho những thí nghiệm tiếp theo tương ứng với X 1 = -0,2 và X 2.
- Nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu được tính.
- Kết quả xác định thu được giá trị nhiệt độ trích ly tối ưu là 46°C và thời gian tương ứng là 44,6 phút.
- Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính protease trong thịt đầu tôm sú tăng đều từ 20 đến 60 phút đối với điều kiện nhiệt độ 30 và 40C, và giảm dần theo thời gian phút ở các nhiệt độ cao hơn.
- Thịt đầu tôm sú là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly protease.
- Dịch trích ly enzyme protease thu được từ thịt đầu tôm sú có tổng hoạt tính cao nhất là 13,48 (U/g CKNT) khi tiến hành trích ly bằng dung môi là đệm Glycine – NaOH có pH 9,0 và tỷ lệ mẫu và dung môi 1: 4 (w/v), sử dụng nhiệt độ trích ly 50°C và thời gian ủ 40 phút.
- Từ kết quả thu được, các tính chất và thông số động học của chế phẩm protease thu được từ thịt đầu tôm sú và thử ứng dụng chế phẩm để thủy phân protein trong công nghệ thực phẩm sẽ được khảo sát tiếp tục.