Nghiên cứu trích ly lipase (EC 3.1.1.3) từ nội tạng cá lóc nuôi

- NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPASE (EC 3.1.1.3) TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC NUÔI Trần Thanh Trúc * và Nguyễn Văn Mười.
- Cá lóc nuôi, lipase, nội tạng, trích ly.
- Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly lipase từ nội tạng của cá lóc nuôi.
- Tiến hành khảo sát sự hiện diện của lipase ở các bộ phận nội tạng riêng lẻ và sự ổn định hoạt tính của lipase có trong nội tạng cá lóc theo thời gian trữ đông.
- Từ bộ phận nội tạng cá lóc thích hợp đã được xác định, khảo sát các yếu tố có tác động đến hiệu quả trích ly lipase, bao gồm: (i) ảnh hưởng của các yếu tố riêng lẻ (tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, thay đổi từ 1:1 đến 1:6, w/v, pH của dung môi với 8 mức khảo sát, từ pH 3 đến pH 10).
- Kết quả khảo sát cho thấy, trong nội tạng cá lóc, lipase được trích ly từ gan tụy và ruột cá lóc có hoạt tính cao hơn so với dạ dày.
- Cấp đông và trữ đông nguyên liệu ở nhiệt độ -18±2°C giúp duy trì hoạt tính lipase có trong nội tạng cá lóc đến 8 tuần.
- Dịch chiết lipase thu được từ hỗn hợp nội tạng cá lóc (loại bỏ dạ dày) có hoạt tính cao nhất là 78,42 U/g chất khô nguyên liệu (CKNL) khi sử dụng đệm phosphate pH 6 với tỷ lệ nội tạng và dung môi là 1:4 (w/v).
- nhiệt độ trích ly tối ưu là 40,3°C trong thời gian 211,2 phút..
- Nghiên cứu trích ly lipase (EC 3.1.1.3) từ nội tạng cá lóc nuôi.
- dẫn đến việc loại bỏ một lượng rất lớn nội tạng cá lóc và được bán với giá thấp trực tiếp tại các cơ sở sản xuất khô, các chợ.
- Nội tạng cá lóc được thu mẫu trực tiếp tại điểm mua bán cá lóc ở các chợ đầu mối trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ (4 chợ: chợ Xuân Khánh, chợ Cái Khế, chợ Trần Việt Châu và chợ An Bình).
- Thời gian từ khi nội tạng lấy khỏi thân thịt cá đến khi chuyển đến phòng thí nghiệm cần đảm bảo không quá 3 giờ..
- Nội tạng cá lóc thu được ở tất cả các nơi được trộn lại với nhau để đảm bảo tính đồng nhất.
- 2.2.2 Phương pháp trích ly lipase từ nội tạng cá lóc.
- Nội tạng cá lóc lạnh đông được nghiền bằng máy quay sinh tố (tốc độ quay của motor ở mức 2, 3.000 rpm) trong thời gian 3 phút trước khi quá trình trích ly enzyme bắt đầu.
- Quá trình trích ly sử dụng khuấy từ, tốc độ 200 rpm trong thời gian là 150 phút nhằm tăng khả năng trích ly.
- Hoạt tính enzyme lipase (U/g).
- 2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định các tính chất cơ bản và sự phân bố của lipase có trong nội tạng cá lóc nuôi.
- của nội tạng cá lóc (nội tạng hỗn hợp, dạ dày, ruột, gan và tụy), làm cơ sở cho việc phân riêng bộ phận có hoạt tính lipase cao, sử dụng cho quá trình ly trích và thu nhận lipase tiếp theo..
- Nội tạng cá lóc sau khi thu mua được xử lý, phân thành 4 nhóm: nội tạng hỗn hợp, dạ dày, ruột, gan và tụy.
- Việc trích ly lipase được sử dụng theo phương pháp đã đề cập ở Mục 2.2.2, với dung môi là nước cất với tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi là 1:1 (w/v), thời gian trích ly là 150 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng (30±2C)..
- 2.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian trữ đông nội tạng cá lóc đến sự ổn định của enzyme lipase.
- Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzyme lipase có trong nội tạng cá lóc theo thời gian trữ đông ở nhiệt độ -18±2C.
- Bộ phận nội tạng cá lóc có hoạt tính lipase cao được cấp đông và trữ đông để tiến hành thu nhận enzyme.
- Ứng với từng thời gian trữ đông theo khảo sát, mẫu được xay mịn và tiến hành trích ly lipase.
- Xác định hoạt tính enzyme lipase (U/g CKNL (chất khô nguyên liệu)) có trong dịch trích sau khi ly tâm, từ đó kết luận tính ổn định của enzyme lipase trong nội tạng cá lóc ở nhiệt độ bảo quản -18±2C..
- 2.3.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc nuôi.
- Mục tiêu của nghiên cứu là xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc, bao gồm tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, pH của dung dịch đệm trích ly, tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase..
- Bộ phận nội tạng cá lóc thích hợp (đã được lựa chọn, thí nghiệm 1) được sử dụng làm nguyên liệu trích ly enzyme.
- Chú ý chỉ sử dụng mẫu nội tạng đã được trữ đông theo khoảng thời gian thích hợp đã lựa chọn từ thí nghiệm 2.
- Khối lượng nội tạng sử dụng cho một mẫu khảo sát là 50 g..
- Trước hết, xác định tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly lipase đạt hiệu quả cao nhất được thực hiện bằng cách bổ sung các tỷ lệ nước cất khác nhau vào mẫu nội tạng cá lóc (tỷ lệ nội tạng và nước.
- Dựa trên hoạt tính của lipase có trong mẫu khảo sát (U/g, CKNL), chọn ra tỷ lệ mẫu nội tạng cá lóc và nước cất sử dụng phù hợp giúp hiệu quả thu nhận lipase đạt cao nhất..
- Tiến hành thực hiện thí nghiệm trích ly lipase ở nhiệt độ phòng (302°C) và thời gian trích ly 150 phút.
- Xác định tương tác của nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc được thực hiện theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Bảng 1: Ma trận quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc.
- Hàm mục tiêu (Y) là hoạt tính lipase (U/g, CKNL), X 1 : Nhiệt độ trích ly (C) và X 2 : thời gian trích ly (phút).
- Vẽ đồ thị bề mặt đáp ứng, xác định nhiệt độ và thời gian trích ly tối ưu..
- 3.1 Xác định các tính chất cơ bản và sự phân bố của lipase có trong nội tạng cá lóc nuôi.
- Kết quả xác định tỷ lệ phân bố của các bộ phận nội tạng cá lóc (Bảng 2) cho thấy, gan và tuỵ là thành phần chủ yếu nhất chiếm đến cao khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với tỷ lệ ruột và dạ dày .
- Bảng 2: Tỷ lệ phân bố và tính chất hóa lý của các thành phần nội tạng cá lóc nuôi Thành phần Tỷ lệ phân bố.
- tổng nội tạng).
- lý khảo sát của nội tạng cá lóc ở các đợt lấy mẫu không nhiều.
- Giá trị pH của nội tạng cá lóc nằm trong khoảng 6,57÷6,71 chứng tỏ nguyên liệu thu hoạch vẫn còn độ tươi (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phương, 1989).
- Nhìn chung, độ ẩm của các thành phần nội tạng cá lóc khảo sát tương đối cao cùng với hàm lượng protein trong nguyên liệu cũng ở mức cao cbk) đối với gan tụy và mẫu hỗn hợp.
- Kết quả phân tích hàm lượng lipid tổng số trong nội tạng cá lóc cho giá trị khá cao khoảng cbk) ở các bộ phận ruột, gan, tụy và hỗn hợp nội tạng.
- Do đó, nguyên liệu nội tạng cá lóc sau khi thu mua và xử lý cần phải được trữ đông để đảm bảo hoạt tính được ổn định trong quá trình trích ly..
- Hoạt tính của các enzyme tiêu hóa phụ thuộc vào bản chất của thành phần nội tạng do mỗi enzyme tập trung ở một số cơ quan nhất định.
- Trong phạm vi nghiên cứu, xác định hoạt tính của lipase trong nội tạng cá lóc ở các bộ phận khác nhau để có cơ sở lựa chọn, phân riêng bộ phận nội tạng thích hợp cho việc trích ly enzyme đạt hiệu quả cao nhất và ít chịu sự tác động của các thành phần khác..
- Hình 1: Sự thay đổi hoạt tính lipase ở các bộ phận nội tạng cá lóc khác nhau Kết quả (Hình 1) cho thấy, lipase tập trung nhiều.
- Nghiên cứu trích ly enzyme tiêu hoá từ nguồn nguyên liệu là toàn bộ nội tạng cho thấy có sự sụt giảm đáng kể hoạt tính lipase khi so sánh với nguồn gan tuỵ, điều này có thể do ở dạ dày (27,12%) không 0,94a.
- Hoạt tính lipase (U/g CKNL).
- Kết quả khảo sát cho thấy sự cần thiết của việc loại bỏ dạ dày ra khỏi hỗn hợp nội tạng.
- 3.2 Ảnh hưởng của thời gian trữ đông nội tạng cá lóc đến hoạt tính của enzyme lipase.
- Trữ đông là một giải pháp được sử dụng để bảo quản, giúp duy trì nguồn nguyên liệu ổn định cho quá trình trích ly enzyme tiếp theo.
- Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian trữ đông đến hoạt tính lipase từ nội tạng cá lóc Thời gian trữ đông.
- (tuần) Hoạt tính lipase.
- Kết quả khảo sát đã chứng tỏ việc xử lý nguyên liệu nhanh chóng, lạnh đông nhanh và trữ đông ở nhiệt độ -18C đã giúp ổn định hoạt tính lipase có trong nội tạng cá lóc.
- Hoạt tính enzyme lipase trong nội tạng ban đầu là U/g CKNL) và ở tuần trữ đông thứ 8 là U/g CKNL), chỉ giảm khoảng 5% so với hoạt tính lipase ban đầu.
- Nói cách khác, quá trình trữ đông giúp duy trì ổn định hoạt tính lipase trong nội tạng cá lóc (loại bỏ dạ dày) đang khảo sát.
- Kết quả cho thấy, có thể trữ đông nội tạng ở nhiệt độ -18C trong 6 tuần để làm nguồn nguyên liệu trích ly..
- 3.3 Các điều kiện trích ly lipase từ nội tạng cá lóc phù hợp.
- 3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu và dung môi trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase.
- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi sử dụng để trích ly là 1:4 (w/v), hoạt tính của lipase đạt cực đại khi so sánh với các mức độ pha loãng cao hay thấp hơn (giá trị hoạt tính lipase tương ứng là U/g CKNL).
- Bảng 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc.
- Vương Bảo Thy (2015) cũng đề xuất tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:2 (w/v) để trích ly cả protease và lipase từ nội tạng cá tra.
- Việc trích ly lipase từ nội tạng cá lóc chưa được công bố, tuy nhiên kết quả thu được đã cho thấy tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly enzyme phụ thuộc vào từng loại enzyme, nguồn nguyên liệu và có thể phụ thuộc cả vào điều kiện sơ chế, tốc độ ly tâm (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009)..
- Dựa trên kết quả khảo sát, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi sử dụng cho quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc được lựa chọn là 1:4 (w/v)..
- 3.3.2 Ảnh hưởng của sự thay đổi pH dung môi đến hiệu quả trích ly lipase.
- Dựa trên nghiên cứu ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH của dung môi đến quá trình trích ly enzyme, dung dịch đệm ở các giá trị pH khác nhau.
- Bảng 5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc pH của dung dịch.
- Nghiên cứu của Prasertsan and Prachumratana (2008) đã đề xuất giá trị pH trích ly 9 và 10 là phù hợp cho quá trình thu nhận cả lipase và protease từ nội tạng cá ngừ.
- Nói cách khác, điều kiện pH thích hợp cho quá trình trích ly còn phụ thuộc vào đặc tính nguồn cơ chất sử dụng (Prasertsan and Prachumratana, 2008).
- Dựa trên kết quả khảo sát, đệm phosphate với pH 6,0 được sử dụng làm dung dịch trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc cho các khảo sát tiếp theo..
- 3.3.3 Tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase.
- Dựa vào kết quả thí nghiệm thăm dò cho thấy, nhiệt độ và thời gian trích ly là hai yếu tố có tác động lớn đến hiệu quả thu nhận lipase.
- Tiến hành khảo sát sự tương tác của 2 yếu tố này đến khả năng trích ly lipase từ nội tạng cá lóc (bỏ dạ dày) theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
- Kết quả khảo sát được thể hiện qua biểu đồ thể hiện sự tương tác của thời gian và nhiệt độ trích ly đến hoạt tính lipase ở Hình 2 và 3..
- Từ đồ thị tổng quát biểu diễn sự tương tác của cặp nhân tố nhiệt độ và thời gian đến hoạt tính lipase thu nhận ở Hình 2 cho thấy, hai nhân tố này thật sự có sự ảnh hưởng đồng thời đến quá trình trích ly enzyme lipase.
- Hình 2: Đồ thị biểu diễn sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của lipase từ nội tạng cá lóc.
- Đồ thị bề mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng điểm được thể hiện đồng thời ở Hình 3 một lần nữa khẳng định cả hai yếu tố nhiệt độ và thời gian đều ảnh hưởng đến quá trình trích ly lipase từ nội tạng cá lóc.
- Hoạt tính lipase từ nội tạng cá lóc tăng đều từ 10 đến 211 phút đối với điều kiện nhiệt độ 30C và 40C, và giảm dần theo thời gian 300 và 350 phút ở.
- Phương trình thực nghiệm tối ưu hóa hai nhân tố thời gian và nhiệt độ đối với quá trình trích ly thông qua kết quả thí nghiệm có được là:.
- Giá trị thời gian và nhiệt độ tối ưu cho quá trình trích ly enzyme từ nội tạng cá lóc khi giải phương trình hồi quy (1)..
- Hình 3: Đồ thị đường đồng điểm và bề mặt đáp ứng thể hiện sự tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly đến hoạt tính của lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc.
- Dựa theo kết quả thu được trên Hình 3, điều kiện nhiệt độ tối ưu để trích ly lipase từ nội tạng cá là 40,3C tương ứng với 211,2 phút.
- sự tương tác đến hiệu quả trích ly enzyme lipase..
- (2011), thời gian trích ly quá ngắn hay quá dài đều làm giảm hoạt tính enzyme.
- Nếu thời gian trích ly ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên liệu.
- Ngược lại, thời gian trích ly dài sẽ làm giảm hoạt tính enzyme (Ghildyal et al., 1991).
- Nghiên cứu của Knospe and Plendl (1997, trích dẫn bởi Pahojar and Sethar, 2002) đã tìm thấy điều kiện trích ly thích hợp lipase từ nội tạng của dê là ở pH 5,6÷6,5 và khoảng nhiệt độ trích ly thích hợp là 43÷60C.
- Điều này cho thấy, điều kiện trích ly lipase - bao gồm nhiệt độ, thời gian và cả pH dung môi sử dụng phụ thuộc rất lớn vào nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme.
- Trong nghiên cứu này, enzyme lipase từ nội tạng cá lóc có nhiệt độ trích ly tối ưu là 40,3 o C tương ứng với 211,2 phút sử dụng đệm phosphate pH 6, hoạt tính enzyme lipase tối ưu có giá trị là 78,42 (U/g CKNL).
- sát thực tế, chọn lựa mức nhiệt độ 40°C và thời gian ủ là 210 phút, hoạt tính lipase đạt được ở điều kiện trích ly tối ưu là U/g CKNL)..
- Những kết quả thu nhận được từ nghiên cứu đã cho thấy tính khả thi của việc sử dụng nguồn nguyên liệu nội tạng cá lóc nuôi đã được loại bỏ dạ dày (gan, tụy và ruột) trong trích ly và thu nhận chế phẩm lipase.
- Quá trình ly trích lipase từ nội tạng cá lóc nuôi đạt hiệu quả cao nhất khi được tiến hành trong điều kiện tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch trích ly là 1:4 (w/v) với dung dịch đệm là phosphate pH 6.
- Trong khảo sát thực tế, chọn lựa mức nhiệt độ 40°C và thời gian ủ là 210 phút, hoạt tính lipase đạt được ở điều kiện trích ly tối ưu là U/g CKNL)..
- Hoạt tính lipase thực nghiệm.
- Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra