- Bằng môi trường chuyên biệt AFPA (Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Agar) có thể phân lập và đếm số lượng bào tử hai loại nấm A.flavus và A.parasiticus. - Qua kết quả nuôi cấy và phân lập nấm từ nguồn bắp ở kho thức ăn gia súc công ty Afiex An giang, bắp tồn trữ ở bất kỳ độ ẩm nào cũng đều có nhiễm 2 dòng nấm A.flavus và A.parasiticus, không có nhiễm nấm Fusarium. - Kết quả định lượng bằng sắc ký lỏng cao áp cho thấy đã xác định được các loại aflatoxin B l , B 2 ,G l , G 2 có trong các mẫu bắp tồn trữ ở các thời điểm và 12 tuần. - Trong điều kiện khô thoáng, nhiệt độ trung bình 27,4 o C và ẩm độ không khí trung bình 79,3%, độ ẩm trung bình hạt bắp thấp (11,8%) thì có thể trữ hạt đến 2 tháng mà hàm lượng aflatoxin tổng số vẫn dưới mức cho phép. - Hàm lượng aflatoxin tổng số ở các thí nghiệm trữ bắp ở độ ẩm 72% và. - 89% sẽ đạt nhanh đến mức cao khi độ ẩm hạt 13,5%.. - Vì vậy, ngoài việc cố gắng để cải thiện con giống, vệ sinh môi trường hoặc áp dụng các chương trình phòng dịch bệnh phù hợp,… để nâng cao hiệu suất chăn nuôi, các nhà chăn nuôi còn chú trọng nhiều đền chất lượng thức ăn. - 2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Cần Thơ.. - loại nấm sản sinh aflatoxin phát triển trên các loại nông sản, trong thời gian sau thu hoạch và được tồn trữ, bảo quản trong các điều kiện không tốt.. - Đồng thời theo dõi khả năng phát triển của nấm sinh độc tố và hàm lượng aflatoxin sản sinh ra trong thời gian bảo quản nhất định ở kho trữ để từ đó có những khuyến cáo thích hợp nhằm đảm bảo chất lượng thức ăn, góp phần bảo vệ sức khỏe vật nuôi và nâng cao hiệu suất chăn nuôi.. - Phân lập và định danh các loại nấm (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) có khả năng sinh độc tố trên bắp tồn trữ.. - Khảo sát số lượng bào tử nấm sinh aflatoxin và hàm lượng aflatoxin trong bắp ở các thời điểm khác nhau trong quá trình tồn trữ.. - 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm. - Mặc khác chuyển về phòng thí nghiệm 10 kg bắp trữ trong bình hút ẩm ở các độ ẩm tương đối khác nhau 72%, 89%.. - 2.1.2 Bố trí thí nghiệm. - Đếm số lượng bào tử nấm (CFU/g) Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus trong 1 gam bắp. - Chiết tách và làm sạch mẫu, xác định hàm lượng aflatoxin (B l , B 2 ,G l , G 2 ) trong mẫu.. - Khảo sát thí nghiệm trữ bắp ở các thời điểm 3,5,7,9 và 12 tuần theo các nghiệm thức sau:. - Phân lập và định danh các loại nấm trên môi trường thạch Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (AFPA). - Quan sát cấu tạo sợi nấm, bào tử dưới kính hiển vi và phân loại theo Samson, Frisvad (1995).. - Xác định hàm lượng nước (X%) bằng phương pháp sấy ở 105 o C. - Đếm số lượng bào tử nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus bằng môi trường chuyên biệt AFPA pha loãng mẫu theo phương pháp Koch. - Phân tích hàm lượng aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp.. - Kết quả nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. - 3.1 Phân lập và định danh các loại nấm trên bắp. - Nuôi cấy các mẫu bắp thi nghiệm trên các môi trường đặc trưng, chúng tôi đã phân lập được 2 loại nấm trên 2 môi trường DRYES, AFPA.. - Trên môi trường APPA phân lập được 2 dòng A.flavus và A.parasiticus. - Khi phát triển trên môi trường này, khuẩn Lạc có màu vàng cam hoặc nâu sậm ở mặt trái khuẩn Lạc trong vòng 48 giờ sau khi nuôi cấy. - Có rất ít loại nấm sinh màu như A.flavus và các chủng tương tự trên AFPA. - Chỉ có A.niger có thể làm sai lệch kết quả vì nó phát triển nhanh như A.flavus và đôi khi tại màu vàng ở mặt trái khuẩn Lạc nhưng không có màu cam, sau 48 giờ A.niger sinh bào tử có màu đen, dễ dàng phân biệt với A.flavus và A.parasiticus.. - Ngoài ra, A.ochraceus có thể phát triển trên môi trường này và sau 4-5 ngày ủ có thể tạo màu vàng nhưng loại này phát triển chậm ở 30 o C và phản ứng màu không xảy ra trong vòng 48 giờ. - Trên môi trường DRYES chúng tôi còn phân lập thêm được 1 dòng Aspergillus nhưng chỉ xác định được đến giống mà thôi. - Loại Aspergilllus này mọc rất nhanh trên môi trường DRYES, sợi nấm ăn rất sâu vào môi trường.. - Trên môi trường DRYES, chúng tôi phân lập được giống Penicillum. - Giống Penicillum còn gọi là mốc chổi, mốc bàn tay, có sợi nấm ăn sâu vào môi trường. - Dưới kính hiển vi điện tử, sợi nấm có nhiều nhánh tỏa ra như hình cái chổi hoặc bàn tay, ở cuối có mang đính bào tử.. - Qua kết quả phân lập chúng tôi nhận thấy kết quả phù hợp với sự phân lập các giống nấm trên bắp ở miền Nam Việt Nam của Lê Văn Tố và Trần Văn An (1994). - Riêng đối với loại nấm Fusarium thì không phân lập được ở thời gian thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu về nấm và độc tố nấm của Pitt và Hocking (199l) là các loại Fusarium spp. - Dưới đây là một số hình về 2 dòng nấm A.flavus và A.parasitlcus đã phân lập được trên môi trường AFPA.. - Hình 1,2: Mặt trên và dưới khuẩn Lạc A.flavus 3 ngày trên môi trường AFPA. - Hình 3,4: Aspergillus flavus, cấu tạo cuống và đính bào tử (x1000). - Hình 5,6: Mặt trên và dưới khuẩn Lạc A.Parasiticus 5 ngày trên môi trường AFPA. - Hình 7,8: Aspergillus parasiticus, cấu tạo cuống và đính bào tử (x1000). - 3.2 Kết quả ẩm độ hạt bắp của các nghiệm thức ở các thời điểm khác nhau. - Thời gian lấy mẫu từ l/02/99, đây là giao điểm kết thúc mùa mưa sang mùa nắng nên mặc dù nhiệt độ trung bình ở kho cao nhưng ẩm độ tương đối trung bình cũng khá cao nên là điều kiện thuận lợi cho các loại nấm sinh độc tố sinh trưởng và phát triển sinh bào tử. - Theo Moreau (1980), Aspergtllus flavus có khả năng phát triển từ 6-54 o C. - Bảng 1: Nhiệt độ và ẩm độ không khí tương đối tại kho trữ bắp Thời điểm Nhiệt độ trung bình Ẩm độ không khí trung bình. - Bảng 2: Kết quả ẩm độ hạt bắp. - ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian. - Thời điểm NT1 NT2 NT3. - Qua kết quả ở Bảng 2 chúng tôi nhận thấy: Ẩm độ của hạt ở các nghiệm thức trữ hạt 72%. - Cả 2 nghiệm thức, độ ẩm hạt bắp đạt mức tối đa vào thời điểm 9 tuần, sau đó ẩm độ hạt bắt đầu giảm xuống ở nghiệm thức trữ hạt 72% thì độ ẩm hạt tối đa >14% trong khi ở nghiệm thức trữ hạt 89%. - thì độ ẩm hạt tối đa >16%. - Trong suốt quá trình trữ hạt theo thời gian vì độ ẩm có lúc tăng quá cao nên đều này ảnh hưởng đến các kết quả về số lượng bào tử nấm A.flavus và hàm lượng của nó về sau. - Riêng các mẫu bắp trữ ở kho vì điều kiện nhiệt độ bên ngoài khá cao, có độ thoáng nên hầu như độ ẩm của bắp trong suốt thời gian thí nghiệm khác biệt không ý nghĩa. - Các kết quả về số lượng bào tử nấm A.flavus và hàm lượng aflatoxin của nó ít biến động đột ngột, chúng có khuynh hướng tăng không nhanh nhưng khá đều ở các thời điểm trữ bắp.. - 3.3 Kết quả đếm số lượng bào tử nấm A.flavus và A.parasiticus của các nghiệm thức ở các thời điểm khác nhau. - Để biết được số lượng bào tử nấm sinh aflatoxin thay đổi theo các thời điểm trữ bắp, chúng tôi tiến hành đếm số khuẩn Lạc do bào tử nấm trong bắp mọc trên môi trường AFPA (CFU/g) sau 2 ngày cấy mẫu (Hình 9,10).. - Hình 9,10: Mẫu đếm số bào tử trên môi trường AFPA. - Kết quả các thí nghiệm được tóm tắt ở Bảng 3, chúng tôi nhận thấy số lượng bào tử nấm A.flavus biến thiên khá đồng đều khi trữ ở kho (nghiệm thức 2) trong điều kiện tự nhiên, cụ thể qua phân tích các giá trị trung bình khác nhau có ý nghĩa. - Số lượng bào tử đạt mức cao nhất ở thời điểm 9 tuần là 14,5.10 3 . - Riêng ở nghiệm thức trữ bắp 72%, số lượng bào tử nấm A.flavus đạt cao nhất ở 7 tuần trữ và nghiệm thức trữ bắp 89% đạt cao nhất ở 5. - tuần trữ bắp. - Qua 2 thời điểm này, số lượng bài tử ở các thí nghiệm này bắt đầu giảm đột ngột.. - Bảng 3: Kết quả số bào tử (CFU/g) ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian. - So sánh với kết quả bảng ẩm độ hạt cho thấy vì trữ hạt ở điều kiện nhân tạo, nhiệt độ không cao nên độ ẩm của hạt đạt đến mức cao rất nhanh tạo điều kiện thuận lợi cho nấm A.flavus và A.parasiticus phát triển. - Cụ thể, khi độ ẩm hạt đạt 13,5% thì số bào tử nấm A.flavus rất lớn >23. - 10 3 bào tử/g ở cả hai nghiệm thức l và 3. - Nhưng sau khi qua đến độ ẩm hạt >14% thì số lượng bào tử nấm bắt đầu giảm. - Trong thực nghiệm, chúng tôi phát hiện cũng trên môi trường AFPA ở những mẫu số lượng bào tử nấm A.flavus rất ít, có sự phát triển của 1 số loại nấm khác mọc chậm sau 4-5 ngày cấy mẫu, chủ yếu là các giống Mucor, Rhizopus. - Kết quả này phù hợp với quy luật cạnh tranh của một số loài nấm hoặc vi sinh vật khác tìm thấy trong hạt và ngũ cốc tồn trữ. - Hiển nhiên, điều này còn phụ thuộc vào các yếu tố môi trường khác trong đó yếu tổ ẩm độ đóng vai trò quyết định, nên một số loại nấm khác sẽ lấn áp khả năng phát triển và sinh bào tử của A.flavus và A.parasiticus, là loại nấm ưa ẩm trung bình (Semeniuk,1954). - (1995) nghiên cứu về việc nhiễm A.flavus trên bắp ở Indonesia thì phần lớn bắp nhiễm A.flavus trong suốt mùa khô thường cao mùa ẩm ướt, do và mùa mưa, độ ẩm hạt thường cao và có sự cạnh tranh với các loài nấm khác có mặt trên hạt, gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ lấn áp và phát triển.. - 3.4 Kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin các nghiệm thức ở các thời điểm khác nhau. - Khi phân tích hàm lượng aflatoxin các mẫu bắp ở các nghiệm thức theo thời gian trữ bắp khác nhau bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (sắc ký đồ điển hình ở Hình 11), chúng. - tôi nhận thấy các mẫu bắp nhiễm nấm đều có chứa 4 loại aflatoxin B l , B 2 , G l , G 2 với các kết quả cụ thể ở bảng sau:. - Bảng 4: Hàm lượng aflatoxin ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Thời. - điểm Hàm lượng AFB 1 (ppb) Hàm lượng AFB 2 (ppb) Hàm lượng AFG 1 (ppb) Hàm lượng AFG 2 (ppb). - Qua kết quả cụ thể Bảng 4 về hàm lượng aflatoxin B l , B 2 ,G l , G 2 , chúng tôi nhận thấy hàm lượng aflatoxin chủ yếu dạng B 1 với hàm lượng cao, G 1 có hàm lượng khá cao, G 1 ,G 2 ở mức rất thấp. - Kết quả này là do phụ thuộc vào nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự sản sinh aflatoxin từ cơ chất tự nhiên.. - Bảng 5: Hàm lượng aflatoxin tổng số ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian. - Ở các nghiệm thức trữ bắp 72% và 89%. - Hàm lượng aflatoxin tổng số đạt nhanh ở mức cao tại thời điểm 5 tuần (nghiệm thức 3) là 21,5 ppb và 7 tuần (nghiệm thức 1) là 23,3 ppb. - Hai thời điểm tuy khác nhau nhưng độ ẩm của hạt đều nằm trong khoảng 13,5%.. - So sánh với kết quả số lượng bào tử nấm A.flavus ta thấy tương ứng với số lượng bào tử tăng cao 1à g và 23.10 3 /g. - Ngoài ra ở nghiệm thức trữ bắp 72%, hàm lượng aflatoxin tổng số không tăng thêm nữa khi trữ ở thời gian 9,12 tuần. - Trong khi đó ở thời điểm 7 tuần của nghiệm thức trữ bắp 89%, số lượng bào tử sau thời điểm 5 tuần giảm lại bắt đầu tăng lên và hàm lượng aflatoxin đạt tối đa rất cao là 45,4 ppb.. - Ở nghiệm thức trữ bắp ở kho, hàm lượng aflatoxin tổng sổ đạt cao nhất 39,1 ppb tại thời điểm 9 tuần trữ tương ứng với số lượng bào tử nấm A.Flavus cao nhất là 14,5.10 3 bào tử/g. - Ở nghiệm thức 3 tại thời điểm 5 và 9 tuần trữ, hàm lượng aflatoxin tổng số giảm chỉ còn 0,2 ppb và 0,67 ppb. - Do đó vấn đề này cần tìm hiểu thêm vì ở thí nghiệm này, độ ẩm tương đối trữ hạt cao và trong điều kiện trữ rất kín trong bình hút ẩm nên có những ảnh hưởng và chuyển hóa gì chúng tôi chưa xác định được.. - Ở nghiệm thức trữ bắp 72% và ở kho, tại thời điểm số lượng bào tử nấm A.flavus giảm thì hàm lượng aflatoxin lại giảm theo. - Do bước đầu phân tích và không có điều kiện lặp lại nhiều lần nên kết quả phân tích vẫn còn hạn chế. - Mặc dù vậy nhưng kết quả cho thấy với phương pháp HPLC có thể phân tích được các loại aflatoxin B l , B 2 ,G l , G 2. - (l967) cho rằng một vài chủng Penicillium spp có thể lảm giảm hàm lượng aflatoxin khi sinh trưởng trong môi trường cạnh tranh với A.flavus hoặc theo Ciegler và Peterson (1967) còn cho rằng một vài chủng nhóm A.pergillus niger có thể biến đổi 25 -30% aflatoxin B l. - Qua kết quả thực nghiệm, chúng tôi rút ra các kết luận sau:. - Bắp tồn trữ ở bất kỳ độ ẩm nào cũng đều có nhiễm 2 dòng nấm là Aspergillus flavus và Asperigillus parasiticus, không có nhiễm nấm Fusarium.. - Bắp có độ ẩm hạt thấp (1l,8. - tại kho thức ăn gia súc Afiex An giang có thể trữ hạt đến 2 tháng mà hàm lượng aflatoxin vẫn dưới mức cho phép.. - Hàm lượng aflatoxin tổng sổ ở các thí nghiệm trữ bắp ở độ ẩm 72% và 89% đạt đến mức cao khi độ ẩm hạt l 3.5%.