Phân lập, định danh và đặc điểm của vi khuẩn Aeromonas schubertii gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc (Channa striata) ở Đồng bằng sông Cửu Long

- PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN Aeromonas schubertii GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG TRÊN CÁ LÓC (Channa striata) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG.
- Vi khuẩn Aeromonas schubertii được phân lập và định danh là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc (Channa striata) gây thiệt hại nghiêm trọng với tỉ lệ hao hụt cao trong các trại giống và ao nuôi thâm canh ở 4 tỉnh như: Trà Vinh, An Giang, Đồng Tháp và Đồng Nai.
- Tổng số 192 mẫu cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng được thu từ 53 ao nuôi khác nhau.
- Trên môi trường TSA, vi khuẩn có khuẩn lạc nhỏ màu vàng nhạt, sau 24-36 giờ ủ ở nhiệt độ 28°C, và là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động và oxidase dương tính.
- Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, kit API 20E và kết quả giải trình tự gen 16S rRNA, vi khuẩn này được xác định là loài Aeromonas schubertii.
- Thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh với dấu hiệu bệnh lý giống như ngoài ao nuôi, với giá trị LD 50 của hai chủng vi khuẩn thí nghiệm là 6,59x10 3 CFU/mL và 8,12x10 3 CFU/mL, kết quả này thỏa mãn với định đề Koch.
- Phân lập, định danh và đặc điểm của vi khuẩn Aeromonas schubertii gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc (Channa striata) ở Đồng bằng sông Cửu Long.
- Cá lóc (Channa striata) phân bố rộng trong tự nhiên và thường thấy ở các thủy vực nước ngọt, do tăng trưởng nhanh và thịt cá, thơm ngon là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, ít xương nên được nhiều người ưa thích.
- Cá lóc ngày càng được nuôi phổ biến không những ở Đồng bằng sông Cửu Long mà còn trên cả nước và nhiều nước khác ở châu Á..
- Tuy nhiên, ở ĐBSCL các mô hình nuôi cá lóc chủ yếu là tự phát, để đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, mức độ thâm canh hóa càng được tăng lên, dẫn đến nhiều dịch bệnh phát sinh gây thiệt hại lớn cho nông dân cũng như công tác phòng trị bệnh ngày càng khó khăn (Sinh et al., 2014).
- Trong các bệnh truyền nhiễm trên cá, nhóm vi khuẩn Aeromonas từ lâu được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất trên các loài cá nước ngọt nói chung và trên cá lóc nói riêng.
- Đã có nhiều nơi trên thế giới ghi nhận được sự ảnh hưởng của nhóm Aeromonas đến cá lóc nuôi như vi khuẩn Aeromonas hydrophila được ghi nhận trên cá lóc tại Ấn Độ (Rajendiranne et al., 2008), Malaysia (Talpur et al., 2014), Aeromnas veronii được phân lập trên loài cá lóc (Ophiocephalus argus) Trung Quốc (Zheng et al., 2012.
- Đặc biệt, loài Aeromonas schubertii có khả năng gây nhiễm trùng huyết trên người được phân lập định danh lần đầu bởi Hickman-Benner et al., (1988), cũng được phát hiện loài vi khuẩn này gây thiệt hại đáng kể trên hai loài cá lóc Ophiocephalus argus và Channa maculata tại Trung Quốc (Chen et al., 2012.
- Tại Việt Nam, bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc được ghi nhận quanh năm, có tỉ lệ hao hụt cao, nhất là trong giai đoạn cá giống.
- Thông tin khoa học về bệnh này trên cá lóc đến nay vẫn còn rời rạc và hạn chế.
- Nghiên cứu thực hiện nhằm xác định tác nhân gây bệnh, đặc điểm bệnh học của bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc (Channa striata) ở ĐBSCL, để cung cấp thông tin khoa học cho công tác quản lý dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản..
- Mẫu cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng được thu từ 53 ao nuôi thâm canh ở 4 tỉnh Trà Vinh, An Giang, Đồng Tháp và Đồng Nai (từ tháng 9 năm 2016 đến tháng 2 năm 2018).
- Tổng số mẫu bao gồm 192 mẫu cá lóc có biểu hiện bệnh đốm trắng nội tạng và 35 cá khỏe trọng lượng 50-500 g, được kiểm tra ký sinh trùng, dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và trong tại ao nuôi.
- Mẫu cá lóc bệnh đốm trắng.
- 2.2 Phân lập và định danh vi khuẩn.
- Các chủng vi khuẩn thuần được phân lập từ cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng, phát triển trên môi trường TSA được kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như:.
- Phương pháp định danh vi khuẩn: so sánh được dựa vào các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa theo cẩm nang của Frerichs and Millar (1993), Buller (2004), bộ kit API 20E và ứng dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA tại công ty Macrogen, Hàn Quốc (www.macrogen.com).
- Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTn.
- Kiểm tra nhiệt độ và độ mặn ảnh hưởng đến khả năng phát triển của vi khuẩn.
- Trong điều kiện biến đổi khí hậu, có thể một số chỉ tiêu môi trường trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến sự phát triển của mầm bệnh, đặc biệt là vi khuẩn.
- Để kiểm tra nhiệt độ và độ mặn ảnh hưởng đến khả năng phát triển của vi khuẩn dẫn đến khả năng gây bệnh (độc lực) của vi khuẩn điển hình là 2 chỉ tiêu nhiệt độ và độ mặn.
- Nghiên cứu này đã chọn đại diện 6 chủng vi khuẩn phân lập theo vùng nhiễm mặn: 2 chủng ở An Giang và 4 chủng ở Trà Vinh (2 chủng ở huyện Châu Thành và 2 chủng huyện Trà Cú)..
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong 3 mL môi trường BHI-B và ủ ở các mức nhiệt độ 5 o C, 25 o C, 30 o C, 35 o C, 40 o C, 45 o C..
- Sau khi được ủ trong 24 giờ vi khuẩn được đo độ đục bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng OD = 610 nm (Chen et al.,2012)..
- Ảnh hưởng của độ mặn: 3 mL vi khuẩn được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường BHI-B và có nồng độ muối NaCl tăng dần từ 0%.
- 2.3 Thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD 50 vi khuẩn gây bệnh.
- Cá thí nghiệm: Cá lóc giống khỏe có trọng lượng 9±1,2 gram/con.
- Trước khi gây cảm nhiễm, cá được kiểm tra sức khỏe để đảm bảo hoàn toàn không nhiễm bệnh truyền nhiễm (kí sinh trùng, nấm, vi khuẩn.
- Vi khuẩn gây cảm nhiễm: SCL30 và STC56 phân lập từ cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng tại ao nuôi được sử dụng cho thí nghiệm cảm nhiễm.
- Sau khi vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường brain-heart infusion broth (BHI-lỏng) trên máy lắc ở 28°C trong 24 giờ, tiến hành ly tâm 13000 vòng ở 4°C trong 10 phút, sau đó rửa lại với dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng (0,85% NaCl), lặp lại trong 2 lần.
- Mật độ vi khuẩn được xác định bằng cách đo ở bước sóng 610 nm (OD= 0,1±0,02).
- Sau đó pha loãng vi khuẩn thành các nồng độ cần sử dụng để tiến hành gây cảm nhiễm cho cá.
- Cho 0,1 mL dung dịch vi khuẩn vừa pha lên đĩa TSA trải đều, đem ủ ở 28 o C.
- Bảng 1: Mật độ vi khuẩn sử dụng thí nghiệm cảm nhiễm.
- khuẩn Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) SCL30.
- 1,29×10 5 Phương pháp cảm nhiễm: Cá thí nghiệm được tiêm vi khuẩn vào xoang bụng với liều 0,1 mL/cá tương ứng mật độ vi khuẩn ở Bảng 1.
- Cá lờ đờ hay vừa mới chết được quan sát dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong nội quan, đồng thời được phân lập vi khuẩn ở gan, thận, tỳ tạng trên môi trường TSA và định danh.
- Hình 1: Dấu hiệu bệnh lý cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng, (A) Xuất huyết điểm trên thân và dưới bụng, (B) Đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng cá lóc bệnh (mũi tên).
- Nhiều nghiên cứu cho thấy, bệnh đốm trắng nội quan cũng thường được ghi nhận trên nhiều loại cá khác nhau và tác nhân gây bệnh cũng có sự khác nhau trên từng loài như: cá vược vằn (Morone saxatilis) nhiễm vi khuẩn Mycobacterium marinum gây mủ ở gan, thận, tỳ tạng (Gauthier et al., 2003)..
- Trên cá tra, bệnh gan thận mủ (đốm trắng nội tạng) là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Dung et al., 2008).
- Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) nhiễm vi khuẩn Nocardia spp.
- Theo nghiên cứu của Liu and Li (2012), cá lóc nhiễm vi khuẩn Aeromonas schubertii tại Trung Quốc cũng ghi nhận được những dấu hiệu bệnh lí tương tự, tỉ lệ.
- 3.2 Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh Kiểm tra đặc điểm cơ bản của vi khuẩn: Tổng cộng 55 chủng vi khuẩn được phân lập từ gan, thận, tỳ tạng của cá bệnh đốm trắng nội tạng trên môi trường TSA.
- Quan sát dưới vật kính 100X, vi khuẩn bắt màu Gram âm, có dạng que ngắn, hai đầu tròn (Hình 2C).
- Vi khuẩn có khả năng di động, phản ứng dương tính với oxidase và catalase, có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí..
- Hình 2: Đặc điểm vi khuẩn phân lập.
- (E) Kết quả định danh vi khuẩn phân lập bằng kit API 20E.
- Vi khuẩn có khả năng phát triển và gây tan huyết (dung huyết dạng β) trên môi trường có chứa 5%.
- và nhuộm Giemsa đều thấy rất nhiều vi khuẩn dạng hình que ngắn (Hình 2D) nằm rải rác trên vùng mô phết kính hoặc tập trung thành từng cụm.
- Ở một số mẫu thận cá bệnh, vi khuẩn xâm nhập, phá vỡ tế bào..
- Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng.
- Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API 20E: Kết quả cho thấy 6 chủng vi khuẩn phân lập cho phản ứng dương tính với các chỉ tiêu arginine dihydrolase, voges droskauer, gelatinase, glucose;.
- Khi kiểm tra kết quả trên phần mềm tra cứu kit API 20E xác định được vi khuẩn phân lập được trên cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng thuộc giống Aeromonas spp.
- Như vậy, khi sử dụng bộ kit API 20E không định danh được đến loài của vi khuẩn A.
- Nhiều nghiên cứu đã xác định, cả 2 vi khuẩn A.
- API 20E sẽ rất dễ gây ra sự nhầm lẫn và sai sót khi định danh nhóm vi khuẩn này (Carnaha et al., 1989;.
- Mặt khác, khác với vi khuẩn A.
- schubertii, về hình thái vi khuẩn A.
- Trong khi, khuẩn lạc của vi khuẩn A.
- schubertii có những khác biệt về đặc điểm sinh hóa với các loài trong giống Aeromonas khác do vi khuẩn này không có khả năng lên men đường D-manniton và không sản sinh được iodine trong quá trình chuyển hóa L- tryptophan (Carol et al., 1993).
- Định danh bằng kỹ thuật giải trình tự gen: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và được tra cứu trên ngân hàng Gen bằng chương trình Blast Search đã xác định được cả 6 chủng vi khuẩn phân lập được chọn đại diện (STC94, STC98, SCL30, STC56, STC07 và STC23)..
- Kết quả đã xây dựng cây phả hệ giữa các chủng vi khuẩn bằng phương pháp Maximum Likelihood (Hình 4).
- Xác định, các chủng phân lập có trình tự gen tương đồng là 99% với chủng vi khuẩn chuẩn Aeromonas schubertii khi so sánh trên ngân hàng gen.
- Các nghiên cứu trước đây đã sử dụng phương pháp này để định danh loài vi khuẩn A.
- Như vậy, sau khi kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định được vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc trong nghiên cứu này là Aeromonas schubertii..
- Hình 4: Cây phả hệ các chủng Aeromonas schubertii phân lập trên cá lóc bệnh “đốm trắng nội tạng”.
- Kết quả kiểm tra nhiệt độ và độ mặn ảnh hưởng của đến khả năng phát triển của vi khuẩn Aeromonas schubertii.
- Đa số các chủng vi khuẩn phân lập phát triển trên môi trường dinh dưỡng BHI lỏng có độ mặn từ 0%.
- Mặt khác, các chủng vi khuẩn A..
- schubertii gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ biến động từ 10 o C đến 45 o C, phát triển mạnh nhất ở 25-30 o C (Hình 5B).
- (2012), vi khuẩn A.
- schubertii gây bệnh trên cá lóc (Channa maculata) có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt rộng hơn từ 5 o C đến 45 o C.
- Điều này cho thấy sự biến đổi khí hậu ở ĐBSCL nóng dần lên trong thời gian qua đã có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên khả năng phát triển của mầm bệnh vi khuẩn..
- Hình 5: Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của vi khuẩn A.
- 3.3 Khả năng gây bệnh đốm trắng nội tạng của vi khuẩn phân lập.
- Hai chủng vi khuẩn A.
- Nhìn chung, có sự khác biệt giữa hai chủng vi khuẩn A.
- Từ kết quả thí nghiệm cảm nhiễm xác định được giá trị LD 50 sau 144 giờ của chủng vi khuẩn A.
- schubertii trên cá lóc Channa maculata lần lượt là 1,4×10 4 .
- Như vậy, giá trị LD 50 của chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này cao hơn so với nghiên cứu trước đó.
- Dấu hiệu bệnh lý cá lóc sau cảm nhiễm quan sát được trong thí nghiệm này tương tự với dấu hiệu bệnh lý cá lóc bệnh “đốm trắng nội tạng” trong ao nuôi cá lóc thâm canh tại tỉnh Trà Vinh.
- Các dấu hiệu bệnh lí càng biểu hiện rõ về giai đoạn sau của thí nghiệm cảm nhiễm và kết quả tái phân lập được vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, có các chỉ tiêu sinh hóa tương tự như chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm nên kết quả thí nghiệm đã thỏa mãn định đề Koch.
- Vì vậy, Aeromonas schubertii chính là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc (Channa striata)..
- 3.4 Mô bệnh học cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng.
- Các tổn thương dạng u hạt được quan sát thấy ở gan, thận, tỳ tạng của cá bệnh nhưng tập trung chủ yếu là ở thận và tỳ tạng, kết quả này tương tự như trên cá chẽm (Gauthier et.al., 2003), cá hồi (Ferguson, 2006), cá chim vây vàng (Nguyễn Thị Thùy Giang và ctv., 2013), cá lóc (Nguyễn Thị Ngọc Huyền và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2016), nhưng có sự khác biệt so với kết quả của Chen et al.
- (2012), khi quan sát mô cá lóc cảm nhiễm vi khuẩn A..
- Sự sai khác này có thể do khác biệt về loài cá, điều kiện khí hậu và thời gian gây bệnh của vi khuẩn..
- Hình 7: Cấu trúc mô bệnh học cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng.
- (A), (B), (C): Cấu trúc mô gan, thận, tỳ tạng của cá lóc khỏe.
- Kết quả nghiên cứu đã xác định các chủng vi khuẩn phân lập trên cá lóc (Channa striata) bệnh đốm trắng nội tạng là vi khuẩn Aeromonas schubertii.
- Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm xác định các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng gây bệnh trên cá lóc khỏe trong điều kiện cảm nhiễm thực nghiệm giống như dấu hiệu bệnh ở ao nuôi.
- Kết quả mô bệnh học trên ba cơ quan gan, thận, tỳ tạng cá lóc bệnh đốm trắng nội tạng quan sát được các u hạt vách dày, có lõi tương ứng với các mủ trắng quan sát được trên cá nhiễm bệnh..
- Xác định một số loại gen độc lực của vi khuẩn Aeromonas schubertii để hiểu rõ cơ chế gây bệnh của vi khuẩn lên cá lóc (Channa striata).
- Nghiên cứu chuyên sâu các giai đoạn phát triển bệnh học của bệnh đốm trắng nội tạng trên cá lóc..
- Đặc điểm mô bệnh học của cá lóc (Channa striata) bệnh xuất huyết và bệnh gan thận mủ..
- Nghiên cứu bước đầu về bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng