- PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ SÙNG (Holotrichia parallela) VÀ TRÙN ĐẤT (Lubricus terrestris) Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp và Dương Ngọc Thúy. - Vì vậy, phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose là việc làm rất cần thiết. - Năm mươi mốt dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập từ ruột của sùng (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lubricus terrestris), bao gồm 15 dòng phân lập từ tỉnh Hậu Giang và 36 dòng phân lập từ tỉnh Sóc Trăng. - Đa số các dòng vi khuẩn phân lập có dạng hình que, có khả năng chuyển động, khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô. - Khảo sát khả năng phân hủy cellulose của vi khuẩn cho thấy có 25 dòng vi khuẩn phân lập hoạt tính enzyme cellulase. - Đặc biệt, 3 dòng vi khuẩn CS2, CH8 và TS3 có hoạt tính enzyme cellulase mạnh được nhận diện theo thứ tự là Bacillus cereus strain L5, Bacillus flexus strain KJ1-5-910 và Bacillus subtilis strain 168.. - Phân lập, nhận diện vi khuẩn phân hủy cellulose từ sùng (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lubricus terrestris). - Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều loài nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn được tìm thấy nhiều trong đất, nước, hệ tiêu hóa một số động vật… Đặc biệt là đối với một số côn trùng ăn thực vật thì hệ vi khuẩn đường ruột như Bacillus, Paenibacillus… có khả năng phân hủy cellulose rất tốt (Schwarz, 2001).. - Rút ngắn thời gian phân hủy rơm rạ, cải thiện độ phì nhiêu của đất và bảo vệ môi trường trong canh tác nông nghiệp theo hướng bền vững là những yêu cầu thiết yếu hiện tại. - Với những lý do trên nghiên cứu “Phân lập, nhận diện vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng (Holotrichia parallela) và. - trùn đất (Lubricus terrestris)” được thực hiện nhằm phân lập tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy cellulose mạnh, ứng dụng xử lý phế phẩm nông nghiệp góp phần bảo vệ môi trường.. - Để thực hiện nghiên cứu môi trường phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose (Shengwei et al., 2012), môi trường thử hoạt tính enzyme cellulase (Hedrick et al., 1995), môi trường thử khả năng phân hủy bột giấy, môi trường LB (Sikorski et al., 2002), môi trường glucose-phosphate (peptone 5g/L, glucose 5 g/L, K 2 HPO 4 5 g/L), hóa chất định lượng CMCase, thuốc thử Somogyi, thuốc thử Nelson được sử dụng.. - 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập vi khuẩn. - Khi khuẩn lạc phát triển trên đĩa petri, chọn một khuẩn lạc rời cấy chuyển cho đến khi vi khuẩn ròng.. - 2.2.2 Quan sát đặc tính của vi khuẩn. - Đo kích thước khuẩn lạc, đo kích thước tế bào, quan sát khả năng chuyển động và nhuộm gram vi khuẩn được phân lập theo mô tả của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).. - 2.2.3 Khảo sát định tính khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn. - Mục đích: chọn lọc được một số dòng vi khuẩn phân hủy CMC mạnh dựa trên đường kính phân hủy của các dòng vi khuẩn trên môi trường kiểm tra hoạt tính cellulase.. - Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trong môi trường LB trong 24 giờ, sau đó hút 5 µL dung dịch vi khuẩn nhỏ lên đĩa môi trường CMC đã khử trùng, ủ 48 - 96 giờ. - Xác định đường kính vòng tròn phân hủy bằng cách đổ ngập dung dịch Lugol vào đĩa trong 15 phút, sau đó rửa lại với dung dịch NaCl 1M.. - Kết quả: Có vòng sáng halo thì vi khuẩn có khả năng phân hủy CMC, không có vòng sáng không màu vi khuẩn không phân hủy CMC.. - Công thức tính khả năng phân hủy CMC (Nguyễn Đức Lượng, 2004) như sau:. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi dòng vi khuẩn.. - 2.2.4 Khảo sát khả năng phân hủy bột giấy của các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cellulase. - Hoạt tính của CMCase (Endoglucanase) được xác định khi ủ enzyme cellulase với CMC 0,5%. - Tương tự, hoạt tính của Avicelase (Exoglucanase) được xác định khi ủ enzyme cellulase với bột cellulose 1% trong đệm Sodium. - Tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cellulase trên môi trường CMC và tiến hành khảo sát khả năng phân hủy bột giấy.. - Các bước thực hiện tương tự như khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn trên môi trường CMC, tuy nhiên cơ chất CMC được thay bằng bột giấy.. - 2.2.5 Xác định hoạt tính enzyme cellulase a. - Khảo sát enzyme endoglucanase của các dòng vi khuẩn đã chọn. - Mục đích: Chọn lọc các dòng vi khuẩn tạo CMCase và phân hủy CMC mạnh.. - Các bước thực hiện: Ly trích enzyme các dòng vi khuẩn được chọn ở thí nghiệm trên được chủng vào 20 mL môi trường CMC lỏng, nuôi ở nhiệt độ 30 o C trong 60 giờ. - Hút 10 mL dịch vi khuẩn ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ sinh khối, lấy phần dịch sử dụng như dung dịch enzyme thô.. - Đường kính phân hủy đường kính khuẩn lạc đường kính phân hủy x 100. - Khảo sát enzyme exoglucanase của các dòng vi khuẩn đã chọn. - Phương pháp Nelson-Somogyi xác định hoạt tính enzyme dựa vào lượng đường khử sinh ra thông qua phản ứng trung gian với thuốc thử Nelson-Somogyi. - Ly trích enzyme các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao được chọn ra từ thí nghiệm bột giấy được nuôi tăng sinh trong 20 mL môi trường gồm các thành phần CMC 1%, glucose 0,1%, pepton 5%, cao nấm 2,5% trong bình tam giác đã khử trùng trên máy lắc ở 30 o C, 150 vòng/phút.. - Sau 48 giờ, tiến hành trộn mẫu bằng máy votex đối với dòng vi khuẩn hiếu khí và lắc đều mẫu vi hiếu khí bằng tay. - Chuyển 2 mL dịch nuôi vi khuẩn vào tube 2,2 mL. - Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp Nelson: Pha dung dịch đường chuẩn cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm gồm thành phần các chất theo thứ tự và dựng đường chuẩn và đo xác định lượng đường khử của mẫu thí nghiệm.. - Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1 mL enzyme được tính theo công thức:. - U: hoạt tính enzyme (U/mL). - 2.2.6 Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR Sau khi trích ADN từ các dòng vi khuẩn đã phân lập, tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) với cặp mồi 27f (Jeremy et al., 2007). - Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN, kết hợp với kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để định danh vi khuẩn (Trần Nhân Dũng, 2011).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn. - Năm mươi mốt dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập từ ruột của con sùng và trùn đất. - Trong đó, có 15 dòng phân lập ở tỉnh Hậu Giang và 36 dòng phân lập ở Sóc Trăng.. - Hình 3: Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phát triển sau 24 giờ 3.2 Đặc tính các dòng vi khuẩn phân lập. - Đa số các dòng vi khuẩn phân lập được có khuẩn lạc hình tròn, độ nổi mô hoặc lài, bìa nguyên hoặc răng cưa, khuẩn lạc có màu trắng trong hoặc trắng đục, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 3 mm.. - 3.3 Đặc điểm hình thái và sinh hóa các dòng vi khuẩn được phân lập. - Hình dạng khuẩn lạc: Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có dạng tròn (100. - 3.4 Khả năng phân hủy CMC. - Sau khi nhỏ dịch vi khuẩn đã tăng sinh vào giếng thạch ủ ở nhiệt độ phòng (30 o C) trong 48 giờ, chỉ có 25 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy CMC (Bảng 2, Hình 4).. - Hình 4: Hình vòng sáng halo của các dòng vi khuẩn được phân lập (c. - dòng TH5 Dòng vi khuẩn có đường kính vòng tròn thủy. - Trong đó, có 2 dòng có hoạt tính thủy phân CMC cao nhất và không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức 5%. - Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Cao Mỹ Phượng (2014) khi khảo sát khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn phân lập từ ruột con. - Từ 25 dòng có khả năng tổng hợp enzyme cellulase trên cơ chất CMC cao và có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng vi khuẩn khác, 10 dòng vi khuẩn được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo là CS2, CH8, TS3, TH5, CH5, CH7, CH1, CH5, CH9, CS1 (Bảng 3).. - Bảng 1: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường CMC STT Dòng vi. - khuẩn Chuyển động Gram Hình dạng Kích thước vi khuẩn (µm) Chiều dài Chiều rộng. - Bảng 2: Hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn thể hiện qua đường kính thủy phân cellulose trên môi trường CMC. - STT Dòng vi khuẩn Đường kính. - Bảng 3: Hàm lượng đường khử sinh ra khi thủy phân CMC của 10 dòng vi khuẩn có hoạt tính mạnh. - STT Dòng vi. - Kết quả cho thấy cả 10 dòng vi khuẩn sau khi đã trích dịch enzyme thô cho phân hủy dung dịch CMC đều tạo ra lượng đường khử. - Trong đó, 3 dòng vi khuẩn CS2, CH8, TS3 có lượng đường khử cao lần lượt 63,1 µg/mL, 60,3 µg/mL, 59,6 µg/mL và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các dòng vi khuẩn còn lại ở mức 5%.. - (2014) khi ông nghiên cứu các vi khuẩn phân lập từ ruột côn trùng ăn thực vật có khả năng phân hủy cellulose.. - 3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase trên môi trường bột giấy. - Tất cả 10 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose với cơ chất CMC đều có khả năng tổng hợp enzyme để thủy phân cellulose ở dạng cơ chất bột giấy. - Trong đó, dòng vi khuẩn có đường kính. - Bảng 4: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn trên môi trường cơ chất là bột giấy. - STT Dòng vi khuẩn. - 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme CMCase (Endoglucanase) và Avicelase (Exoglucanase) của 10 dòng vi khuẩn bằng phương pháp Nelson-Somogyi. - Hoạt tính enzyme endoglucanase có sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn. - Dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme endoglucanase cao là dòng vi khuẩn CS2 (0,043 U/mL), kế đến là dòng CH8 (0,037 U/mL) và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5% so với các dòng vi khuẩn còn lại (Bảng 4).. - (2015) khi phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sâu đục thân cây mía Diatraea saccharalis, kết quả phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus pumilus kd109 có hoạt tính enzyme endoglucanase là 0,23 U/mL. - Kết quả nghiên cứu của Ray et al.. - (2007) cho thấy hai dòng vi khuẩn Bacillus subtilis CY5 và Bacillus circulans TP3 phân lập từ ruột cá trắm cỏ Cyprinus carpio L và Mozambique tilapia khi lên men rắn 120 giờ có hoạt tính cellulase theo. - Hoạt tính enzyme exoglucanase ở các dòng vi khuẩn có sự khác nhau. - Dòng CS2 có hoạt tính enzyme exoglucanase cao là 0,041 U/mL và kế đến là dòng CH8 (0,036 U/mL khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng vi khuẩn còn lại ở mức 5% (Bảng 5). - (2014) khi phát hiện vi khuẩn từ ruột trùn đất của hai dòng vi khuẩn A và B có hoạt tính enzyme Exoglucanase lần lượt là 0,213 FPU/mL và 0,138 FPU/mL.. - Bảng 5: Kết quả khảo sát hoạt tính ennzyme Endoglucanase và Exoglucanase của 10 dòng vi khuẩn. - Hoạt tính enzyme Endoglucanase. - Hoạt tính enzyme Exoglucanaase. - 3.6 Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Hình 5: Kết quả điện di các dòng vi khuẩn Chú thích:. - 3.6.2 Kết quả giải trình tự DNA sản phẩm PCR Ba dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cellulase cao và khả năng phân hủy cellulose tốt chọn lựa nhận diện bằng phương pháp sinh học phân tử là CS2, CH8 và TS3. - Kết quả giải. - trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy dòng vi khuẩn CS2, CH8 và TS3 được nhận diện theo thứ tự là Bacillus cereus strain L5, Bacillus flexus strain KJ1-5-910 và Bacillus subtilis strain 168 với độ đồng hình cao (Bảng 6).. - Bảng 6: Kết quả giải trình tự gen vi khuẩn phân lập STT Ký. - Kết quả giải trình tự định danh các dòng vi khuẩn phân lập cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose mạnh thuộc giống Bacillus. - (1984) khi phân lập được vi khuẩn Bacillus strain DLG có hoạt tính enzyme exoglucanase là 1,17 U/mL và enzyme exoglucanase là 0,05U/mL có khả năng phân hủy cellulose tốt. - (2012) dòng Bacillus subtilis KACC10111 phân lập từ môi trường đất nông nghiệp có khả năng phân hủy cellulose với hoạt tính enzyme endoglucanase là 0,16 U/mL.. - (2011) cho thấy nuôi cấy Bacillus cereus trên cơ chất bột mì có bổ sung nitrogen enzyme cellulase đạt 16,94 IU/mL và nuôi cấy trên cơ chất bột giấy Whatman, hoạt tính enzyme cellulase là 0,13 IU/mL. - (2012) cho thấy khi ứng dụng Bacillus cereus phân hủy bã Cọ bằng phương pháp lên men rắn, hoạt tính enzyme cellulase là 3,693 FPU/mL.. - Năm mươi mốt dòng vi khuẩn đã được phân lập từ ruột của con sùng và con trùn ở tỉnh Hậu Giang và Sóc Trăng. - Trong đó, 25 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme cellulase với hoạt tính cao.. - Cả 3 dòng CS2, CH8, TS3 đều có khả năng phân hủy CMC trên bột giấy.. - Đặc biệt chọn được 3 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp được cả hai hoạt tính endoglucanase và exoglucanase cao là CS2, CH8 và TS3 được nhận diện theo thứ tự là Bacillus cereus strain L5, Bacillus flexus strain KJ1-5-910, Bacillus subtilis strain 168.