- PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VI KHUẨN PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ RÁC HỮU CƠ, RUỘT SÙNG (Holotrichia parallela) VÀ TRÙN ĐẤT (Lubricus terrestris). - Bacillus, enzyme amylase, phân hủy tinh bột, ruột sùng và trùn đất, xử lý chất thải Keywords:. - Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa phân hủy tinh bột triển vọng để xử lý chất thải từ các cơ sở chế biến tinh bột. - Để hoàn thành mục tiêu đó, các kỹ thuật truyền thống cũng như kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã được sử dụng để phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ các bãi rác hữu cơ, ruột sùng (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lubricus terrestris). - Kết quả có 58 dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường tinh bột 1% và đa số chúng có tế bào hình que, có khả năng chuyển động, Gram dương, tạo bào tử, sinh catalase và sinh acid. - Qua thí nghiệm khảo sát khả năng phân hủy tinh bột, có 57/58 dòng tiết ra enzyme amylase để phân hủy tinh bột tạo thành vòng sáng rõ rệt khi nhuộm với dung dịch Lugol. - Trong đó, 5 dòng phân hủy tinh bột triển vọng RB8, RB17, TB6, SB16 và SB25 đã được chọn để giải trình tự gene 16S rRNA và định danh theo thứ tự là Bacillus flexus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus và Bacillus flexus.. - Phân lập, nhận diện vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác hữu cơ, ruột sùng (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lubricus terrestris). - Trong ba đại phân tử hữu cơ protein, cellulose và tinh bột thì tinh bột có thải lượng chỉ đứng sau cellulose, nên việc chuyển đổi chất thải tinh bột có trong rác hữu cơ, nước thải của các cơ sở sản xuất bún, bánh pía… được quan tâm thực hiện bằng nhiều biện pháp như xử lý sinh học chất thải tinh bột trước khi thải ra môi trường, chuyển đổi phế phẩm tinh bột thành nhiên liệu (cồn) hoặc chế biến các phế phẩm ấy trong chăn nuôi gia súc… làm cho chất thải tinh bột trở nên hữu dụng và không gây ô nhiễm môi trường.. - Để thực hiện được giải pháp nêu trên thì chìa khóa chính là sử dụng hệ enzyme amylase từ lợi khuẩn được phân lập và phát triển từ chính nguồn chất thải tinh bột và một số côn trùng bản địa để chuyển đổi tinh bột thành đường glucose. - Với lý do tìm kiếm những dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột triển vọng, nghiên cứu “Phân lập, nhận diện vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác, ruột Sùng (Holotrichia parallela) và Trùn đất (Lubricus terrestris)” được thực hiện.. - Môi trường phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột gồm các thành phần K 2 HPO 2 1,9 g/L, KH 2 PO 4 0,94 g/L, KCl 1,6 g/L, NaCL 1,43 g/L, NH 4 Cl 0,15 g/L, MgSO 4 .7H 2 O 0,037 g/L, CaCl 2 .2H 2 O 0,017 g/L, yeast extract 0,1 g/L, tinh bột gạo 10 g/L, pH 7,02 và agar 18g/L (Shengwei et al., 2012).. - Cycloheximide (0,1 g/L) được thêm vào môi trường phân lập để kháng nấm.. - 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập vi khuẩn. - đều 0,1mL mẫu ở các nồng độ lên môi trường phân lập bằng que trải thủy tinh và ủ hiếu khí ở 30 o C trong 72 giờ. - Đối với sùng và trùn đất, mẫu được khử trùng bề mặt bằng cồn 70 o trong 5 phút sau đó khử trùng bằng H 2 O 2 3% trong 5 phút, mổ lấy ít ruột (khoảng một vòng que cấy) trải đều lên môi trường phân lập bằng que trải thủy tinh, ủ ở 30ºC trong 72 giờ ở điều kiện hiếu khí. - Khi khuẩn lạc phát triển, chọn những khuẩn lạc rời rạc để tách ròng bằng phương pháp cấy ria trên môi trường phân lập (Shengwei et al., 2012. - Kumar et al., 2012).. - 2.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn. - Khảo sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm đặc điểm khuẩn lạc, Gram, kích thước tế bào vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002), khả năng tạo bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2006) và khả năng di động (Nguyễn Lân Dũng, 2006).. - Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bao gồm khả năng sinh acid và khả năng sử dụng oxy của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2006).. - 2.2.3 Khảo sát khả năng phân hủy tinh bột Phương pháp giếng thạch được dùng để chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột triển vọng và có nguyên lý như sau: cơ chất tinh bột hòa tan tạo phức màu tím xanh với dung dịch Lugol và khi cơ chất này bị phân hủy bởi enzyme amylase của vi khuẩn thì sẽ tạo nên một vùng phân hủy xung quanh khuẩn lạc (không bắt màu) dễ dàng nhìn thấy bằng mắt thường (Alariya et al., 2013). - Khả năng phân hủy tinh bột (E) được đánh giá qua hiệu số giữa đường kính vòng sáng phân hủy (D) và đường kính khuẩn lạc (d) phát triển từ giếng (E=D-d). - Giá trị E càng lớn thì vi khuẩn phân hủy tinh bột càng mạnh.. - 2.2.4 Xác định hoạt tính amylase a. - Phương trình đường chuẩn dùng để xác định nồng độ đường khử sinh ra bởi sự phân hủy cơ chất tinh bột của enzyme amylase.. - Xác định hoạt tính amylase. - Nuôi vi khuẩn trong bình tam giác chứa môi trường sinh enzyme gồm các thành phần bacteriological peptone 6 g/L,MgSO 4 .7H 2 O 0,5 g/L, KCl 0,5 g/L, tinh bột 1 g/L, trên máy lắc 150 vòng/phút trong 60 giờ (Ekunsanmi, 2009). - Sau 60 giờ nuôi, trộn đều mẫu bằng máy Vortex và chuyển 10 mL dịch nuôi vi khuẩn vào ống nghiệm khác để. - Thêm 1 mL tinh bột 5%. - Tiếp tục thêm 1 mL tinh bột 5% (V ddTB5. - Nồng độ đường khử sinh ra (X) bởi sự phân hủy tinh bột của endoglucanase là hiệu số giữa nồng độ đường khử trong mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.. - U: hoạt tính enzyme (UI/mL);. - 2.2.5 Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA Chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột triển vọng để khuếch đại đoạn gene 16S rRNA. - 2.2.6 Giải trình tự đoạn gene 16S rRNA Sản phẩm PCR được tinh sạch và kiểm tra nồng độ DNA sau khi tinh sạch và được giải trình tự bằng máy ABI PRISM 3130. - Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN để định danh chúng cùng với các đặc điểm hình thái, sinh hóa (Trần Nhân Dũng, 2011).. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập. - Ba mươi dòng vi khuẩn từ bãi rác đã được phân lập trên môi trường tinh bột 1% và được ký hiệu là RB1, RB2,...RB30. - Đồng thời, cũng trên môi trường tinh bột 1%, 14 dòng vi khuẩn đã được phân lập từ ruột con sùng (ký hiệu là SB15, SB16,…SB28) và 14 dòng được phân lập từ ruột con trùn đất (ký hiệu là TB1, TB2,…TB14).. - Đa số các dòng vi khuẩn có dạng tròn (82,76. - Tế bào của 58 dòng vi khuẩn đều có dạng que trong đó dạng que ngắn chiếm đa số (89,66%) so với số ít dòng có tế bào que dài (10,34. - Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng di động khi nuôi trong môi trường thạch LB (Luria Broth agar).. - Chiều dài của tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,87-3,74 µm và chiều dài ngang dao động trong khoảng 0,52-15 µm. - Số tế bào vi khuẩn có Gram dương là 36 dòng (62,07%) và số tế bào Gram âm là 22 dòng (37,93. - Có 36 dòng có khả năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que và Gram dương.. - Tất cả 58 dòng vi khuẩn đều có phản ứng dương tính với thuốc thử H 2 O 2 , tức đều có khả năng sinh catalase. - Trong khi, số dòng vi khuẩn sinh acid, tức làm đổi màu Methyl red thì ít hơn với 41 dòng.. - 3.1.2 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn. - Phân lập từ rác. - Tất cả 30 dòng vi khuẩn phân lập từ rác đều tạo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc trên môi trường tinh bột 1% (sau 72 giờ ủ ở 30 o C) khi nhuộm với. - Khả năng phân hủy tinh bột (E) của các dòng vi khuẩn dao động trong khoảng 1,57 đến 23,5 mm. - Dòng RB8 phân hủy tinh bột mạnh nhất với giá trị E 23,5 mm. - Dựa theo khả năng phân hủy tinh bột, hai dòng này đã được chọn để giải trình tự đoạn gene 16S rRNA và định danh.. - Bảng 1: Khả năng phân hủy tinh bột của 30 dòng vi khuẩn. - Dòng Khả năng phân hủy E (mm) Dòng Khả năng phân hủy E (mm). - Hình 1: Vòng sáng phân hủy tinh bột Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy bột của các dòng vi khuẩn RB8 (b), RB17 (a), RB30 (d) và dòng vi khuẩn không có khả năng phân hủy tinh bột (c). - Bảng 2: Hoạt tính enzyme amylase của hai dòng triển vọng. - STT Vi khuẩn. - Hoạt tính amylase (UI/mL). - Phân lập từ ruột sùng và ruột trùn. - Dựa vào vòng sáng phân hủy khi nhuộm với dung dịch Lugol (Hình 2), có 27 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột với giá trị E dao động từ 5,7 mm đến 23,4 mm. - Ba dòng SB25, TB6 và SB16 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất với giá trị E tương ứng là 23,4 mm, 21,7 mm và 21,57 mm (Bảng 3). - Khi khảo sát hoạt tính enzyme amylase, mặc dù dòng SB25 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất nhưng hoạt tính enzyme amylase lại thấp nhất với 13,64 UI/mL, trong khi hoạt tính amylase cao nhất được ghi nhận ở dòng TB6 (Bảng 4). - Sự khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường phân lập và môi trường xác định hoạt tính enzyme amylase là khác nhau.. - Bảng 3: Khả năng phân hủy tinh bột của 27 dòng vi khuẩn. - Dòng Khả năng phân hủy E (mm) Dòng Khả năng phân hủy E(mm). - Hình 2: Vòng sáng phân hủy tinh bột. - Vòng sáng phân hủy tinh bột của hai dòng vi khuẩn SB16 (a) và TB6 (b) Bảng 4: Hoạt tính enzyme amylase các dòng vi. - Vi khuẩn Hoạt tính amylase (UI/mL). - 3.1.3 Kết quả giải trình tự và định danh Giếng 20 (dòng RB8) và giếng 21 (dòng RB17) ở Hình 3 và giếng 2 (dòng SB25), giếng 3 (dòng TB6) và giếng 4 (dòng TB16) ở Hình 4 đều có band ở vị trí khoảng 1500 bp nghĩa là quá trình PCR đã khuếch đại được đoạn gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn này và sản phẩm của quá trình PCR đã được dùng để giải trình tự.. - Dòng RB8 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA khi so sánh trình tự gene 16S rRNA của dòng này với trình tự gene 16S rRNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI (Bảng 5). - Theo Zhao et al. - (2008) và Pal et al. - (2014), Bacillus flexus là một loài vi khuẩn Gram dương, hình que, di động, sử dụng được O 2 và có khả năng tạo nội bào tử. - Quá trình khảo sát của luận án cũng cho thấy dòng RB8 là vi khuẩn Gram dương, hình que (dài), di động và có thể sống trong môi trường hiếu khí.. - Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus flexus là vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột và có tiềm năng ứng dụng cao. - Theo nghiên cứu của Zhao et al., (2008),a Bacillus flexus là loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột rất tốt trong môi trường kiềm. - Năm 2013, (Chen et al., 2013) đã nghiên cứu sử dụng Bacillus flexus để xử lý nước thải có nồng độ COD cao với kết quả 81,04% COD được loại bỏ.. - Dòng RB17 có độ tương đồng 99% với vi khuẩn Bacillus subtilis strain NG3-5 16S (Bảng 5). - của dòng RB17 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). - Khả năng phân hủy tinh bột của loài vi khuẩn Bacillus subtilis đã được tìm thấy ở nhiều nghiên cứu như:. - Panneerselvam và Elavarasi (2015) phân lập được dòng Bacillus subtilis từ đất có khả năng sinh enzyme α-amylasephân hủy tinh bột. - Năm 2012, Vijayalakshmi et al. - cũng đã phân lập được dòng Bacillus subtilis KC3 từ đất có khả năng phân hủy tinh bột mạnh cũng như khả năng sản sinh α- amylase cao với hoạt tính 25 UI/mL.. - Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng TB6 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). - Bên cạnh đó, Bacillus megaterium là một loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột trong quá trình sinh trưởng của chúng nhờ hệ enzyme amylase (David et al., 1987). - Enzyme α-amylase từ loài Bacillus megaterium cũng đã được nghiên cứu sử dụng trong thương mại (Brumm et al., 1991). - ra, dòng Bacillus megaterium sensu stricto có khả năng tổng hợp enzyme β-amylase và được dùng cùng các vi khuẩn khác để xử lý nước thải từ các cơ sở chế biến, sản xuất sản phẩm có liên quan đến tinh bột (Mary et al., 1980).. - Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng SB16 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). - Trong khi đó, Bacillus cereus là loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột (Sanjoy et al., 2009) và còn được dùng để sản xuất amylase sử dụng trong công nghiệp (Sivakumar et al., 2012).. - Dòng SB25 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA khi so sánh trình tự gene 16S rRNA của dòng này với trình tự gene 16S rRNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI (Bảng 5). - Quá trình khảo sát của luận án cũng cho thấy dòng SB25 là vi khuẩn Gram dương, hình que (dài), di động và có thể sống trong môi trường hiếu khí.. - Khả năng phân hủy tinh bột của loài Bacillus flexus đã được thảo luận như trên.. - Bảng 5: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI Dòng. - vi khuẩn Kết quả so sánh với dữ liệu NCBI Đoạn gene giải. - trình tự (NU) Mức độ đồng. - RB8 Bacillus flexus gene for 16S rRNA 1377 96 LC189347.1. - TB6 Bacillus megaterium gene for 16S rRNA 1298 97 LC085342.1. - Nghiên cứu đã phân lập được 58 dòng vi khuẩn từ các mẫu rác, con sùng và trùn đất thu ở tỉnh Sóc Trăng trên môi trường tinh bột 1%. - Trong đó có 57 dòng vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme amylase phân hủy tinh bột. - Các dòng phân hủy tinh bột triển vọng RB8, RB17, TB6, SB16 và SB25 đã được giải trình tự gene 16S rRNA và định danh tương ứng là Bacillus flexus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus và Bacillus flexus.