- PHÂN LẬP THỰC KHUẨN THỂ VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA DO VI KHUẨN XANTHOMONAS ORYZAE PV. - Kết quả nghiên cứu phân lập Thực khuẩn thể (TKT) kí sinh và tiêu diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. - Kết quả trong tổng số 26 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh phân lập tại 4 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long gồm An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc Liêu thì phân lập được 10 dòng TKT, chiếm tỉ lệ kí sinh 38,46%. - Khi đánh giá về khả năng kí sinh của các dòng TKT cho thấy 4 dòng TKT có mã số và 17 (TKT và 17) có khả năng kí sinh trên nhiều chủng vi khuẩn, và hai chủng vi khuẩn Xoo có mã số 44 (phân lập tại huyện Thới Lai- Cần Thơ, Xoo 44) và 52 (phân lập tại Long Mỹ- Hậu Giang, Xoo 52) là mẫn cảm cao nhất đối với các dòng TKT được phân lập. - Khi khảo sát khả năng thực khuẩn của 4 dòng TKT và 17 trên chủng vi khuẩn Xoo 44, thì dòng TKT 12 (phân lập tại Châu Thành A – Hậu Giang) có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo 44 cao hơn các dòng TKT 10, 13, 17. - Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh trong điều kiện nhà lưới, cả 4 dòng TKT và 17 qua hai biện pháp xử lý (phun trước hoặc phun sau với huyền phù mang mật số 10 8 pfu/ml) đều thể hiện hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xoo 44 gây ra, biện pháp phun trước thể hiện hiệu quả cao hơn đối với hai dòng TKT 10 và 12, và hai dòng TKT 10 và 12 thể hiện hiệu quả phòng trị bệnh cao hơn hai dòng còn lại.. - Bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) là bệnh hại quan trọng trên lúa, bệnh gây thiệt hại năng suất lúa nghiêm trọng được ghi nhận trên thế giới. - Tuy nhiên, hiện nay Việt Nam vẫn chưa có nhiều giống kháng đối với bệnh này, bên cạnh đó các giống kháng cũng không bền vững nếu sử dụng trong thời gian dài do sự biến đổi liên tục của quần thể vi khuẩn gây bệnh. - Phòng trừ sinh học đối với bệnh do tác nhân là vi khuẩn được ghi nhận thành công khi sử dụng các vi khuẩn đối kháng, hay kích kháng cây trồng bằng hoá chất hay dịch trích thực vật (Raupach và Kloepper, 1998. - Ngoài ra, sử dụng TKT cũng được ghi nhận thành công đối với các bệnh do vi khuẩn (Flaherty và ctv., 2000. - TKT là vi rút có khả năng kí sinh tế bào vi khuẩn và giết chết tế bào vi khuẩn trong thời gian ngắn (Kutter và Sulakvelize, 2005). - Ngày nay, sử dụng TKT cũng được xem là tác nhân phòng trừ sinh học quan trọng và thuốc trừ bệnh bằng TKT đã được thương mại hoá gần đây để phòng trừ bệnh do vi khuẩn (Balogh và ctv., 2010). - Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu ghi nhận về sử dụng TKT trong phòng trị bệnh do vi khuẩn trên cây trồng đặc biệt là đối với bệnh cháy bìa lá lúa. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập các dòng TKT đối với vi khuẩn Xoo ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo trong điều kiện phòng thí nghiệm và hiệu quả phòng trị bệnh của TKT đối với bệnh trong điều kiện nhà lưới, với mục đích nhằm tìm ra chủng TKT có khả năng tiêu diệt nhiều chủng vi. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập các dòng TKT phân bố ở các tỉnh ĐBSCL. - Phân lập vi khuẩn Xoo: Mẫu lá bị bệnh được thanh trùng bề mặt bằng cồn 70%, sau đó lá bệnh được cắt nhỏ ra trên miếng lam thanh trùng, dùng micropipette rút vài giọt nước cất thanh trùng nhỏ lên mẫu bệnh sau khi cắt. - Đợi khoảng 1 phút cho vi khuẩn trong mô lá phân tán vào giọt nước bên ngoài. - Dùng micropipette rút 1 giọt huyền phù chuyển vào đĩa Petri chứa môi trường King’B agar hoặc Wakimoto đã được thanh trùng, và dùng đũa vạch vi khuẩn phân tán giọt huyền phù vi khuẩn đều trên bề mặt đĩa chứa môi trường King’B agar.. - Dựa vào hình thái khuẩn lạc và thực hiện tách ròng để thu được vi khuẩn Xoo. - Các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra khả năng gây hại bằng cách chủng bệnh nhân tạo trên lúa, và các chủng vi khuẩn Xoo này sẽ được dùng làm nguồn để phân lập TKT ở thí nghiệm sau.. - Tế bào thực vật lắng dưới đáy ống nghiệm, phần dung dịch trong chứa TKT và vi khuẩn được lọc qua dụng cụ lọc vi khuẩn (có đường kính lổ lọc 0,2 μm), thu được phần dung dịch qua lọc chỉ chứa TKT. - Rút 500 μl dung dịch qua lọc cho vào ống nghiệm chứa môi trường King B agar đã nấu tan để nguội 50 o C phối hợp với 100 μl huyền phù vi khuẩn Xoo phân lập từ mẫu bệnh tương ứng, hoà đều và đổ vào đĩa Petri thanh trùng. - Đĩa được ủ trong điều kiện phòng và quan sát sự hình thành các vòng vô khuẩn (plaque), đó là nơi vi khuẩn đã bị tiêu diệt bởi virút. - Thí nghiệm kiểm tra khả năng kí sinh của 10 dòng TKT trên 26 chủng vi khuẩn Xoo phân lập tại. - Thực hiện phương pháp pha loãng và đổ đĩa để thu đơn plaque từng dòng TKT.. - Chuẩn bị đĩa cấy chứa vi khuẩn Xoo bằng cách rút 250 µl huyền phù vi khuẩn Xoo (10 9 cfu/ml) (xác định mật số vi khuẩn trong huyền phù bằng phương pháp đo độ quang truyền ở bước sóng 600 nm, sau đó dựa vào đường chuẩn để quy ra mật số, từ đó thực hiện pha loãng để tạo ra huyền phù vi khuẩn Xoo) cho vào 10 ml môi trường King’s B agar đã nấu tan để nguội ở 50 o C, hòa đều và đổ ra đĩa Petri thanh trùng. - Dùng tăm bông vô trùng vít plaque đơn tương ứng từng dòng trên đĩa Petri, sau đó vạch đường Ziczac vào đĩa petri chứa vi khuẩn Xoo. - Mỗi đĩa Petri vạch 5 dòng TKT khác nhau và mỗi đĩa là một lần lặp lại. - Chỉ tiêu ghi nhận: Xác định khả năng tiêu diệt vi khuẩn của các dòng TKT trên các kí chủ khác nhau thông qua sự hình thành vòng vô khuẩn trên đĩa Petri sau 24 giờ.. - 2.3 Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo của TKT trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, với số nghiệm thức là số dòng TKT có phổ kí chủ rộng và 1 chủng vi khuẩn bị kí sinh nhiều nhất bởi các dòng TKT từ thí nghiệm 2.2.. - Các dòng TKT được chọn từ thí nghiệm 2.2 được nuôi trong đĩa petri cho nhân mật số trong 24 giờ. - Đếm số plaque hình thành sau 24 giờ từ đó xác định được mật số TKT trong huyền phù (PFU/ml), thực hiện phương pháp pha loãng để đạt huyền phù của các dòng TKT khác nhau với mật số 10 3 PFU/ml.. - Chỉ tiêu ghi nhận: quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn (plaque) mà từng dòng TKT phân giải trên đĩa Petri vào các ngày sau khi nuôi cấy bằng cách đo 20 vòng vô khuẩn ngẫu nhiên trên đĩa và lấy trung bình, số liệu được phân tích. - oryzae) của một số dòng TKT triển vọng trong điều kiện nhà lưới. - Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 5 lần lặp lại và 9 nghiệm thức trong đó gồm: 4 dòng TKT được chọn từ thí nghiệm 2.2 ở mật số 10 8 plaques/ml với hai biện pháp xử lý TKT khác nhau (phun trước hoặc phun sau khi chủng bệnh 1 ngày), và một nghiệm thức đối chứng chủng bệnh không xử lý TKT.. - Chuẩn bị nguồn TKT: TKT được nuôi trong đĩa Petri chứa môi trường Wakimoto 0,6% agar + vi khuẩn Xoo, sau 24 giờ thu hoạch huyền phù TKT, xác định mật số bằng phương pháp pha loãng và đổ đĩa, đếm số lượng plaques hình thành sau 24 giờ và suy ra mật số TKT trong huyền phù ban đầu, sau đó thực hiện pha loãng đưa về mật số như nhau là 10 8 PFU/ml.. - Chuẩn bị nguồn vi khuẩn gây bệnh Xoo: Chủng vi khuẩn Xoo bị nhiều TKT kí sinh nhất được nuôi trên đĩa Petri chứa môi trường Wakimoto trong 4 ngày, sau đó cho 10 ml nước muối sinh lý vô trùng 0,9% vào để thu hoạch huyền phù vi khuẩn. - Xác định mật số vi khuẩn trong huyền phù bằng phương pháp đo độ quang truyền ở bước sóng 600 nm, sau đó dựa vào đường chuẩn để quy ra mật số, từ đó thực hiện pha loãng để tạo ra huyền phù vi khuẩn Xoo mật số (2,5x10 11 cfu/ml).. - Phương pháp chủng bệnh: khi lúa được 45 NSKG, thực hiện chủng bệnh nhân tạo bằng kéo nhún vào huyền phù vi khuẩn Xoo sau đó cắt các chóp lá lúa (khoảng 2 cm từ chóp vào), mỗi lần nhún kéo vào huyền phù sẽ thực hiện cắt 1 lá. - 3.1 Phân lập các dòng TKT phân bố ở các tỉnh ĐBSCL. - Bằng phương pháp phân lập TKT của vi khuẩn X .oryzae pv. - oryzae trên mẫu lá lúa bị bệnh cháy bìa lá ở các tỉnh ĐBSCL, kết quả ghi nhận trong tổng số 26 chủng vi khuẩn Xoo phân lập từ các huyện khác nhau thuộc bốn tỉnh gồm An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc Liêu thì chỉ có sự hiện diện của 10 dòng TKT chiếm tỉ lệ 38,46% phân bố tại các huyện khác nhau thuộc 3 tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang và Bạc Liêu (Bảng 1), trong đó Cần Thơ (4 chủng), Hậu Giang (5 chủng) và Bạc Liêu (1 chủng).. - Bảng 1: Danh sách chủng vi khuẩn X.oryzae pv. - STT Mã số Vị trí phân lập vi khuẩn Xoo trên lúa TKT. - Bảng 2: Khả năng kí sinh của 10 dòng TKT trên 26 chủng vi khuẩn X. - Xoo Mã số các dòng thực khuẩn thể kí sinh của vi khuẩn Xoo Tổng số TKT kí sinh VK. - đĩa Petri chứa môi trường King’ B và vi khuẩn kí chủ. - King’B và vi khuẩn kí chủ. - Kết quả cho thấy rằng có thể phân lập TKT của vi khuẩn Xoo từ môi trường trên không (tán lá cây). - Điều này cho thấy rằng, nơi chứa TKT nằm trong đất, có TKT kí sinh bên trong vi khuẩn rơi từ cây xuống mặt đất.. - Một nghiên cứu khác về TKT trên cùng một vi khuẩn kí chủ như trên, đã tìm thấy TKT E.. - 3.2 Khả năng kí sinh của 10 dòng TKT trên vi khuẩn X. - Kết quả (Bảng 2) cho thấy rằng, 26 chủng vi khuẩn Xoo có sự biến động về số lượng TKT kí sinh, thấp nhất là 1 TKT và cao nhất là 8 TKT kí sinh. - Trong đó, chủng vi khuẩn Xoo 44 và 52 (Thới Lai - Cần Thơ và Long Mỹ - Hậu Giang) bị kí sinh nhiều nhất bởi các dòng TKT được phân lập từ các vị trí khác nhau trong 26 chủng vi khuẩn Xoo khảo sát với số lượng dòng thực khuẩn kí sinh lần lượt là 8 và 7 dòng TKT. - Chủng vi khuẩn Xoo 29 được ghi nhận không bị tấn công bởi 10 dòng TKT.. - Như vậy, kết quả ghi nhận được dòng thực khuẩn và 17 kí sinh cao với nhiều chủng vi khuẩn Xoo trong 26 chủng được phân lập từ các địa điểm khác nhau, với số lượng chủng vi khuẩn Xoo bị kí sinh lần lượt là và 14 chủng.. - Các dòng TKT 7, 9, 2BL, 14, 40, và 58 kí sinh dưới 10 chủng vi khuẩn Xoo được phân lập.. - 3.3 Khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn Xoo 44 của 4 dòng thực khuẩn thể và 17. - Kết quả Bảng 3 cho thấy qua bốn thời điểm khảo sát của 4 dòng TKT và 17 thể hiện qua đường kính phân giải vi khuẩn với mức độ khác nhau.. - Trong đó dòng TKT 12 có đường kính phân giải là 2,0 mm cao hơn và khác biệt so với các dòng TKT còn lại. - Tiếp đến là đường kính phân giải dòng TKT 13 (1,7 mm) và 17 (1,7 mm) không khác biệt nhau và khác biệt với dòng TKT 10 (1,6 mm).. - Ở thời điểm 24 GSKNC thì bốn dòng TKT đều cho hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn với đường kính phân giải từ 3,8 – 5,1 mm. - Trong đó, dòng thực khuẩn 10, 12 và 13 có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê với dòng TKT 17 với đường kính phân giải lần lượt là 4,9 mm. - Ở thời điểm 36 GSKNC thì bán kính phân giải vi khuẩn Xoo của bốn dòng TKT tăng lên đạt từ 5,9 – 8,3 mm, dòng TKT 12 có đường kính phân giải cao nhất (8,3 mm) khác biệt ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. - Tiếp theo là hai dòng TKT 10 (7,2 mm) và 13 (7,3 mm) có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn không khác biệt nhau và khác biệt với dòng TKT 17 (5,9 mm).. - Ở thời điểm 48 GSKNC thì đường kính phân giải của bốn chủng TKT đạt từ mm, dòng TKT 12 (11,7 mm) có đường kính phân giải khác biệt ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại.. - Tiếp theo là hai dòng TKT 10 (10,8 mm) và 13 (10,3 mm) có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn không khác biệt nhau, tuy nhiên đạt cao hơn và khác biệt với dòng TKT 17 (8,1 mm).. - Như vậy, dòng TKT 12 phân lập từ mẫu lá lúa bị bệnh cháy bìa lá ở huyện Châu Thành A, Hậu Giang có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo 44 cao hơn các dòng TKT trong điều kiện in vitro. - solanacearum và 5 dòng TKT ức chế Erwinia chrysanthemi thể hiện qua đường kính phân giải từ khoảng 6 – 17 mm trong 24 – 48h.. - Ngoài ra, dòng TKT 12 cũng được ghi nhận có khả năng kí sinh nhiều dòng vi khuẩn nhất trong tất cả các dòng TKT phân lập được (kết quả phần 3.2).. - Như vậy, đây là dòng TKT có khả năng thực khuẩn cao nhất trong các dòng TKT phân lập trong nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm.. - Bảng 3: Đường kính phân giải của 4 dòng thực khuẩn thể với vi khuẩn X. - 3.4 Hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn X. - Thí nghiệm khảo sát hiệu quả của bốn dòng TKT và 17 qua hai biện pháp xử lý (phun trước và phun sau với huyền phù từng dòng TKT 10 8 pfu/ml) trong phòng trị đối với bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn X. - Chủng Xoo 44 (phân lập từ huyện Thới Lai- Cần Thơ) là chủng vi khuẩn mẫn cảm cao với nhiều dòng TKT được chọn từ thí nghiệm 2.2.. - Biện pháp xử lí phun trước đối với dòng TKT 13 (11,29 cm) và 17 (12,13 cm) không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng. - Biện pháp xử lí phun sau đối với 4 dòng TKT không khác biệt so với đối. - Ở thời điểm 14 NSKLB, biện pháp xử lí phun trước cũng như biện pháp phun sau đối với 4 dòng TKT và 17 đều có chiều dài vết bệnh không khác biệt nhau và thấp hơn khác biệt ý nghĩa thống kê với đối chứng.. - oryzae) của các nghiệm thức xử lý với bốn dòng TKT trong điều kiện nhà lưới. - Dòng TKT Biện pháp xử lí Chiều dài vết bệnh (cm) Cấp bệnh. - (c) Dòng thực khuẩn thể 12 phun trước (d) Đối chứng Nhìn chung, qua kết quả chiều dài vết bệnh thấy rằng, tất cả 4 dòng TKT qua hai biện pháp xử lý đều thể hiện được hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá, tuy nhiên về cấp bệnh chỉ có 3 dòng TKT gồm 10,12 và 13 thể hiện hiệu quả giảm bệnh, trong đó dòng TKT 10 và 12 ở biện pháp phun trước cho hiệu quả ức chế bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xoo ổn định qua các thời điểm khảo sát. - Kết quả này tương đồng với kết quả trong in vitro là dòng TKT 12 có đường kính phân giải vi khuẩn cao và khả năng kí sinh nhiều dòng vi khuẩn cao nhất.. - Qua kết quả này cho thấy hiệu quả phòng trị bệnh của các dòng TKT là khác nhau, có liên quan đến đường kính phân giải vi khuẩn trong in vitro.. - Qua kết quả này cho thấy rằng TKT có khả năng ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh vi khuẩn trên cây trồng, điều này đã được ghi nhận qua nhiều nghiên cứu (Fujiwara và ctv., 2011). - Kết quả này chứng minh rằng, TKT giúp giảm bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xoo gây ra, tuy nhiên hiệu quả chưa thực sự cao vì có thể là do việc chủng bệnh nhân tạo bằng cách cắt lá lúa đã tạo điều kiện quá thuận lợi cho vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào mô cây và phát triển, một khi vào mô cây vi khuẩn sẽ tránh tiếp xúc trực tiếp với TKT nên hiệu quả giảm bệnh không thực sự rõ ràng.. - Ngoài ra, hiệu quả của việc áp dụng thực khuẩn còn dựa vào nhiều yếu tố khác như việc áp dụng TKT như thế nào, về khả năng tồn tại của TKT trên bề mặt tán lá cây, sự hiện diện của vi khuẩn kí chủ v.v (Jones và ctv., 2007). - Do đó, việc áp dụng vào chiều tối sẽ cho kết quả kiểm soát đốm vi khuẩn cà chua tốt hơn vào ban ngày với hiệu quả giảm bệnh 27% so với 13%. - Ngoài ra, nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến cả tuổi thọ thực khuẩn thể trên lá cây (Iriarte và ctv., 2007) và khả năng phân giải vi khuẩn của các thể thực khuẩn (Civerolo, 1972;. - Tuy nhiên, nhiệt độ và độ ẩm tương đối khác nhau đối với các dòng TKT khác nhau và phụ thuộc điều kiện thực hiện thí nghiệm.. - Hơn nữa, một nghiên cứu trước đây chứng minh rằng TKT chỉ cung cấp đủ kiểm soát nếu có trên những tán lá cây trước khi sự xuất hiện nguồn bệnh do vi khuẩn, và nó là không hiệu quả trong việc làm giảm quần thể vi khuẩn sau khi xâm nhập vào cây trồng (Civerolo, 1969. - Balogh (2002) ghi nhận TKT cho kết quả kiểm soát bệnh đốm vi khuẩn cà chua nếu áp dụng ở 10 6 hoặc 10 8 PFU/ml và không hiệu quả đối với 10 4 PFU/ml.. - Thể thực khuẩn đã được kết hợp thành công với tác nhân gây cảm ứng SAR trong quản lý của bệnh đốm vi khuẩn cà do vi khuẩn và Xanthomonas gây cháy lá của củ hành (Obradovic và ctv., 2004. - Ứng dụng kết hợp TKT với các tác nhân kiểm soát sinh học khác như vi khuẩn đối kháng, hay bổ sung vi khuẩn kí chủ không có đặc tính gây bệnh cho các thể thực khuẩn nhằm tạo nguồn thực phẩm cho nhân mật số đủ mạnh để có thể hạn chế hiệu quả vi khuẩn gây bệnh khi chúng xuất hiện và xâm nhiễm, đây là một chiến lược thành công trong việc kiểm soát bệnh cháy lụi (fire blight) trên lê và héo xanh vi khuẩn trên thuốc lá (Tanaka và ctv., 1990, Svircev và ctv., 2006. - Kết quả phân lập được 10 dòng TKT trên tổng số 26 chủng vi khuẩn Xoo khác nhau tại các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang, Bạc Liêu.. - Bốn dòng thực khuẩn có phổ kí chủ rộng là và 17, và hai chủng vi khuẩn Xoo 44 và 52 là mẫn cảm cao nhất đối với các dòng TKT được phân lập.. - Khảo sát khả năng thực khuẩn của 4 dòng TKT và 17 trên chủng vi khuẩn Xoo44, thì dòng TKT 12 có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Xoo 44 cao hơn các dòng TKT . - Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh trong điều kiện nhà lưới: cả 4 dòng TKT và 17 qua hai biện pháp xử lý (phun trước hoặc phun sau với huyền phù mang mật số 10 8 pfu/ml) đều thể hiện hiệu quả bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xoo 44 gây ra. - Hai dòng thực khuẩn thể 10 và 12 phân lập tại Châu Thành A- Hậu Giang là hai dòng TKT thể hiện hiệu quả phòng trị bệnh cao hơn các dòng TKT còn lại ở biện pháp phun trước.. - Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 231-1 đối với bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani và cháy bìa lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.