- PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM VÙNG RỄ LÚA CÁC TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG. - Đất phù sa, đất mặn, điều kiện nhà lưới, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn vùng rễ lúa. - Đề tài đã thực hiện phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn cố định đạm cao từ mẫu đất vùng rễ lúa thu thập ở Đồng bằng sông Cửu Long với 02 sinh thái là đất phù sa và đất mặn. - Vi khuẩn được phân lập trên môi trường Burk không đạm, sau đó nhân sinh khối và xác định hàm lượng NH 4 + bằng phương pháp Indophenol Blue.. - Các dòng vi khuẩn có hàm lượng đạm cao nhất được sử dụng để tuyển chọn các dòng tốt nhất qua khả năng cung cấp đạm cho cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Các dòng vi khuẩn cho kết quả tốt nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm tiếp tục khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa ở điều kiện nhà lưới. - Kết quả tuyển chọn xác định được 8 dòng vi khuẩn có tác động tốt đến cây lúa ở điều kiện phòng thí nghiệm và 02 dòng vi khuẩn của mỗi vùng sinh thái có khả năng thay thế từ 25-50% phân đạm cho cây lúa trồng trong chậu ở nhà lưới, gồm AM3, TV2B7 (đất mặn), CT1N2 và CTB3 (đất phù sa). - Định danh các dòng vi khuẩn này, xác định được chúng có quan hệ gần nhất theo thứ tự với các loài: Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus megaterium, Ideonella sp. - Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ lúa có khả năng cố định đạm cũng đã được khá nhiều tác giả công bố (Menard et al., 2007. - Phân lập vi khuẩn vùng rễ lúa trên hai loại đất của vùng ĐBSCL bao gồm đất phù sa và đất nhiễm mặn, trên môi trường phân lập chuyên biệt dành cho vi khuẩn cố định đạm. - Các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao được tuyển chọn trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới thông qua hiệu quả tác động của vi khuẩn trên giống lúa OM 6976 và định danh các dòng vi khuẩn triển vọng bằng phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rDNA kết hợp khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa.. - 2.2.1 Phân lập và kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn vùng rễ lúa. - Môi trường phân lập vi khuẩn là Burk không đạm gồm: Sucrose (10 g/l), KH 2 PO 4 (0,41 g/l), K 2 HPO 4 (0,52 g/l), NaSO 4. - Kiểm tra khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn: Vi khuẩn cố định đạm có thể phát triển trên môi trường không đạm do chúng có khả năng tổng hợp đạm từ không khí. - Những dòng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt được tuyển chọn và nuôi trong môi trường Burk lỏng để đo nồng độ amonium trong dịch nuôi bằng phương pháp Indophenol Blue.. - 2.2.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao. - Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho cây lúa trồng trong dung dịch Yoshida (Yoshida et al., 1976) ở giai đoạn mạ.. - Chọn các dòng vi khuẩn phân lập từ mỗi vùng sinh thái có hàm lượng NH 4 + trong dịch nuôi cao nhất để khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa giai đoạn mạ trong điều kiện phòng thí nghiệm.. - Nuôi sinh khối các dòng vi khuẩn được chọn và chuẩn về mật số 10 7 CFU/ml trước khi chủng vào cây mạ. - Chủng vi khuẩn vào cây mạ bằng cách ngâm mạ (5 ngày tuổi) trong dung dịch vi khuẩn (trong 2 giờ). - Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho cây lúa trồng trong chậu. - Chọn các dòng vi khuẩn có hiệu quả cao nhất ở giai đoạn mạ để khảo sát khả năng thay thế phân đạm hóa học cho cây lúa trồng trong chậu. - Mạ sau khi chủng với các dòng vi khuẩn được cấy vào chậu theo các nghiệm thức tương ứng, mỗi chậu 2 cây. - 2.2.3 Định danh các dòng vi khuẩn có hiệu quả cung cấp đạm cao cho cây lúa. - Các dòng vi khuẩn cho hiệu quả tốt nhất với cây lúa trồng trong chậu được định danh bằng giải. - 3.1 Phân lập và kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn vùng rễ lúa. - Kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ cố định đạm Từ 114 mẫu đất vùng rễ lúa của 4 tỉnh, thành đề tài đã phân lập được tổng cộng là 290 dòng vi khuẩn. - Hai tỉnh Kiên Giang và Trà Vinh với sinh thái đất nhiễm mặn có 178 dòng vi khuẩn. - Trung bình từ một mẫu đất/ruộng phân lập được từ 1 đến 3 dòng vi khuẩn khác nhau.. - Kiểm tra khả năng tổng hợp NH4 + của các dòng vi khuẩn phân lập. - Tất cả 290 dòng vi khuẩn được khảo sát hàm lượng NH 4 + trong dịch nuôi bằng phương pháp so màu Indophenol Blue sau khi tiến hành nuôi trong môi trường Burk lỏng không đạm sau 2, 4, và 6 ngày. - Bảng 1: Hàm lượng NH 4 + của các dòng vi khuẩn tổng hợp được ở hai vùng sinh thái Stt Vi khuẩn. - Vi khuẩn vùng mặn. - Từ kết quả phân tích thống kê ở Bảng 1 chọn được 08 dòng vi khuẩn từ vùng phù sa gồm. - 08 dòng vi khuẩn từ vùng đất mặn là TV2B7, AM3, TV1, TV58, TV112, TV92, TV107, TV109, có hàm lượng NH 4 + trung bình cao hơn, khác biệt có ý nghĩa thống kê với các dòng vi khuẩn còn lại.. - 3.2 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho canh tác lúa. - Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao cho cây lúa trồng trong dung dịch Yoshda ở giai đoạn mạ. - Các dòng vi khuẩn chọn được dựa vào nồng độ NH 4 + trong dịch nuôi ở Bảng 2 được tiếp tục khảo sát khả năng cung cấp đạm cho cây lúa OM6976 trồng trong dung dịch Yoshida ở giai đoạn mạ. - Các NT có chủng các dòng vi khuẩn cho chiều cao cây cao hơn hoặc khác biệt không có ý nghĩa với ĐC+. - là tất cả các dòng vi khuẩn ở vùng đất phù sa và các dòng TV58, AM3, TV109 ở vùng đất mặn.. - Bảng 2: Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đến chiều cao cây và khối lượng chất khô của cây lúa OM 6976 giai đoạn 20 ngày tuổi. - Khối lượng chất khô: Đây là chỉ tiêu quan trọng cho biết khả năng cung cấp đạm của các dòng vi khuẩn giúp cây lúa phát triển vì đạm là thành phần chính cấu tạo nên khối lượng chất khô. - Các NT có KLCK cây mạ cao hơn hoặc khác biệt không ý nghĩa so với ĐC+ ở vùng đất phù sa là các nghiệm thức chủng với các dòng vi khuẩn CT1N2, CT1N3, CTB3 và VL2.27. - Bốn dòng vi khuẩn tuyển chọn ở mỗi vùng sinh thái bao gồm CT1N2, CT1N3, CTB3 và VL2.27 (đất phù sa). - Ở các NT chủng vi khuẩn và không bón đạm chỉ có dòng vi khuẩn CTB3 là cho KLKR cao hơn (24,7 g) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với ĐC-. - Ở các NT không bón đạm có chủng vi khuẩn, chỉ có 2 NT chủng 2 dòng vi khuẩn là AM3 và TV2B7 là có KLKR cao (12,9 g và 10,9 g), khác biệt có ý nghĩa so với ĐC- (5,8 g).. - Khối lượng hạt/bụi (g/bụi): Đây là chỉ tiêu chính đánh giá hiệu quả cung cấp đạm của các dòng vi khuẩn. - Xét ở từng mức phân bón, khả năng thay thế phân đạm hóa học của các dòng vi khuẩn như sau:. - Bảng 3: Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn tuyển chọn từ các vùng sinh thái đến khối lượng khô rơm và năng suất của giống lúa OM6976 trồng trong chậu Nghiệm. - Các dòng vi khuẩn vùng phù sa: VK1: CT1N2, VK2:CT1N3, VK3: CTB3 và VK4: VL2.27. - Các dòng vi khuẩn của vùng đất mặn lại cho hiệu quả rất tốt khi cả 4 dòng đều cho NS bụi cao hơn g/bụi), khác biệt có ý nghĩa so với ĐC- (2,69 g). - ở mức phân bón 25%N, tất cả các NT chủng các dòng vi khuẩn ở cả 2 vùng sinh thái đều cho NS bụi cao hơn ĐC- nhưng không có dòng nào cho năng suất cao hơn hoặc khác biệt không có ý nghĩa với ĐC+. - ở mức phân bón 50%N, mỗi vùng sinh thái đều có 2 dòng vi khuẩn cho NS bụi khác biệt không có ý nghĩa. - dòng vi khuẩn AM3 (13,77 g/bụi) và TV2B7 (13,62 g/bụi) ở vùng đất mặn, so với ĐC+ (14,96 g/bụi. - Ở vùng đất mặn, 3 dòng vi khuẩn cho NS bụi khác biệt không có ý nghĩa với ĐC+ (14,96 g/bụi) là TV112 (14,76 g/bụi), TV2B7 (14,60 g/bụi) và AM3 (13,85 g/bụi). - Từ kết quả phân tích cho thấy các dòng vi khuẩn CT1N2, CTB3 (đất phù sa), AM3, TV2B7 (đất mặn), vừa cho KLKR cao vừa cho năng suất cao, có khả năng thay thế từ 25-50% phân đạm hóa học trong điều kiện nhà lưới. - Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đến lúa trồng ở điều kiện nhà lưới đã được nhiều nghiên cứu thực hiện. - (2011) khi chủng 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. - BT2 trên lúa cao sản trồng trong chậu cho thấy 2 dòng vi khuẩn này có thể thay thế 25-50%N khác biệt không có ý nghĩa trong thí nghiệm này.. - (2012) trên chủng Azospirillum lipoferum R29b1 cho thấy, chủng vi khuẩn này cũng có khả năng thay thế 50% đạm hóa học cho lúa cao sản trong điều kiện nhà lưới.. - 3.3 Định danh các dòng vi khuẩn cho hiệu quả cố định đạm cao. - Trong 8 nguồn carbon khảo sát, chitin là nguồn carbon chỉ có một dòng vi khuẩn là AM3 sử dụng được và dòng vi khuẩn này cũng có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae (Nguyễn Thị Pha và ctv. - Các nguồn carbon còn lại các dòng vi khuẩn đều có khả năng sử dụng, ngoại trừ dòng vi khuẩn CT1N2 không sử dụng được nguồn carbon là mannitol. - Sucrose là nguồn carbon mà 4 dòng vi khuẩn phát triển tốt nhất. - Nguyên nhân có thể do đây là nguồn carbon ban đầu sử dụng trong môi trường Burk để phân lập vi khuẩn. - Tất cả các dòng vi khuẩn khảo sát đều cho phản ứng catalase dương tính nhưng ở mức độ nhẹ. - Điều này cho thấy cả 4 dòng vi khuẩn thuộc nhóm vi hiếu khí. - Vi khuẩn phân lập được trong đề tài là vi khuẩn vùng rễ lúa nên kết quả này là phù hợp. - Các dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm cao làm tăng pH môi trường và làm môi trường chuyển màu xanh dương. - Kết quả khảo sát khả năng đổi màu môi trường cho thấy cả 04 dòng vi khuẩn đều có khả năng làm thay đổi màu môi trường sang xanh dương (Hình 1). - Điều này cho thấy các dòng vi khuẩn đều có khả năng cố định đạm và làm tăng pH của môi trường. - Bảng 4: Đặc tính 04 dòng vi khuẩn tuyển chọn. - Đặc tính Dòng vi khuẩn. - Hình 1: Khả năng làm đổi màu môi trường NFB của 6 dòng vi khuẩn sau 4 ngày chủng Ngày chụp 16/4/2014. - Trình tự vùng gen 16S rDNA của 6 dòng vi khuẩn được khuếch đại bằng cặp mồi tổng 27 F và 1495R, và đọc trình tự tự động trên máy ABI 3130. - Kết quả giải trình tự cho thấy cả 4 dòng vi khuẩn được tuyển chọn, đều thuộc các chi vi khuẩn có khả năng cố định đạm đã được nhiều tác giả công bố (Gyaneshwar et al., 2001. - 2006…) Bảng 5: Kết quả giải trình tự 04 dòng vi khuẩn tuyển chọn. - Dòng vi khuẩn CTB3: Kết quả giải trình tự cho thấy dòng vi khuẩn này tương đồng với một số loài thuộc chi Serratia. - (2012) loài Serratia marcescens có khả năng sinh trưởng trên nhiều nguồn carbon khác nhau như sucrose, D-glucose, D- mannose, D- fructose, có phản ứng catalase dương tính, kết quả này phù hợp với dòng vi khuẩn CTB3 trong nghiên cứu này. - Dòng vi khuẩn CT1N2: Kết quả giải trình tự cho thấy dòng vi khuẩn này tương đồng với dòng Ideonella sp thuộc chi Ideonella. - Đây là chi vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, tế bào có hình que, kích thước 0,5–1,0 µm chiều rộng và 2–6 µm chiều dài có khả năng cố định đạm, chi này phát triển được trên các nguồn carbon: acetate, glucose, mannitol, mannose (Jesse and Daniel, 2009). - Hình chụp dòng vi khuẩn CT1N2 (Hình 2) cho thấy tế bào có dạng hình que ngắn, có chiều dài khoảng 2 μm. - (2013) trên 10 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm phân lập từ đất vùng Aznova Behnamir, Iran cho thấy dòng S. - So sánh với kết quả trong nghiên cứu này về dòng vi khuẩn AM3 cho thấy khá phù hợp về đặc tính sinh lý sinh hóa với loài S. - Khả năng thích ứng với muối NaCl cũng được dòng vi khuẩn AM3 thể hiện trong các thí nghệm trồng lúa để tuyển chọn các dòng vi khuẩn cho sinh thái đất nhiễm mặn trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới (đất trồng lúa ở điều kiện nhà lưới có EC = 12,6 (mS/cm. - Hiện tại, có khá nhiều nghiên cứu về khả năng cố định đạm của chi vi khuẩn này. - (2006) đã phân lập được vi khuẩn Bacillus megaterium có khả năng cố định đạm từ đất của các ruộng lúa ở vùng đồng bằng dọc theo sông Yangtze, Trung Quốc. - (2011) cũng đã phân lập được vi khuẩn Bacillus megaterium cố định đạm sống tự do trong đất canh tác lúa nhiễm mặn tại vùng duyên hải Ấn Độ. - So sánh đặc tính của dòng vi khuẩn là TV2B7 và các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cho thấy, có sự tương đồng về khả năng sử dụng các nguồn carbon.. - Trong nghiên cứu này dòng vi khuẩn TV2B7 cũng được khảo sát tương tác với lúa trong nhà lưới có EC = 12,6 (mS/cm) cho tương tác tốt với cây lúa giúp thay thế từ 25-50% đạm hóa học. - Đề tài đã phân lập được 290 dòng vi khuẩn từ 114 mẫu đất vùng rễ lúa. - Tất cả 290 dòng vi khuẩn. - Xác định được 16 dòng vi khuẩn có tác động tốt nhất lên sinh trưởng của cây mạ trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Bốn dòng vi khuẩn có khả năng thay thế từ 25-50%. - Khảo sát khả năng tồn tại của các dòng vi khuẩn sau khi chủng vào cây lúa (Khả năng nội sinh vào cây lúa hoặc mật số tồn tại trong vùng rễ).. - Tiếp tục thử nghiệm hiệu quả cố định đạm của 6 dòng vi khuẩn tuyển chọn ở điều kiện ngoài đồng tại các vùng sinh thái tương ứng. - Nghiên cứu kết hợp các dòng vi khuẩn nhằm tăng hiệu quả cung cấp đạm cho cây lúa và làm cơ sở cho chiến lược sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh đa chủng.. - Xác định mức độ thay thế phân đạm của vi khuẩn Pseudomonas sp. - Khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum R29B1 có kết hợp các liều lượng phân đạm khác nhau lên sự sinh trưởng và năng suất trên cây lúa trong điều kiện nhà lưới. - Khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của vi khuẩn sinh chitinase phân lập từ đất vùng rễ lúa.