- PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN TRONG ĐẤT TRỒNG LÚA CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU CHỨA HOẠT CHẤT FENOBUCARB. - Two isolates CĐ5.2 and CĐ5.3 obtained from Co Do fields showed the higher fenobucarb degradation with the efficiency of 58.2% and 60.1%, respectively, after nine days of incubation. - Based on 16S-rRNA gene sequence analysis and biochemical characterization including activities of gelatinase, urease, oxidase, citrate assimilation and sugar fermentation, isolates CĐ5.2 and CĐ5.3 were genetically identified as Burkholderia arboris CĐ5.2 and Micrococcus terreus CĐ5.3, respectively.. - Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn bản địa trong đất trồng lúa có khả năng phân hủy hiệu quả fenobucarb. - Hai mươi dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung fenobucarb 100 mg/L như nguồn carbon duy nhất đã được phân lập từ 8 mẫu đất tại huyện Cờ Đỏ và Vĩnh Thạnh, Cần Thơ. - Hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 được phân lập từ đất trồng lúa ở Cờ Đỏ có khả năng phân hủy fenobucarb hiệu quả hơn so với các dòng còn lại, đạt 58,2% và 60,1% sau 9 ngày nuôi cấy. - Dựa vào trình tự gen 16S-rRNA và các đặc điểm sinh hóa như hoạt tính gelatinase, urease, oxidase, đồng hóa citrate và lên men đường, hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 được định danh khoa học lần lượt là Burkholderia arboris CĐ5.2 và Micrococcus terreus CĐ5.3.. - Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn trong đất trồng lúa có khả năng phân hủy thuốc trừ sâu chứa hoạt chất fenobucarb. - Các nghiên cứu xác định khả năng gây chết 50% (LC 50 ) của fenobucarb đối với một số loài cá ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cho thấy fenobucarb gây độc với cá rô và cá chép, cực độc đối với cá lóc (Nguyen et al., 2008. - Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vi khuẩn được phân lập từ đất nông nghiệp đã từng tiếp xúc với thuốc BVTV thuộc nhóm carbamate có khả năng phân hủy các loại thuốc này. - Chẳng hạn, vi khuẩn Novosphingobium sp. - KN65.2 được phân lập từ đất trồng rẫy có khả năng phân hủy carbofuran (Shin, 2012. - Nguyen et al., 2014), vi khuẩn Pseudomonas sp. - CT-VT13 được phân lập từ đất trồng lúa có khả năng phân hủy carbendazim (Le et al., 2017). - Theo Kim et al.. - (2014), vi khuẩn có khả năng phân hủy fenobucarb đã được phân lập từ đất trồng lúa thuộc các chi Sphingobium và Novosphingobium. - Ngoài ra, enzyme carbaryl hydrolase liên quan đến sự phân hủy carbaryl ở vi khuẩn Blastobacter sp. - Hayatsu et al., 2001).. - Chính vì vậy, phân lập, tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn bản địa trong đất trồng lúa ở Cần Thơ có khả năng phân hủy fenobucarb là cần thiết để làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo về xử lý sinh học fenobucarb tồn lưu trong môi trường.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy fenobucarb. - Năm mẫu đất sau khi thu được trộn đều bằng bay (spatula) trong mâm sạch và sau đó thu lấy một mẫu đất đại diện để phân lập vi khuẩn. - Các bước phân lập vi khuẩn được thực hiện như sau: cho 5 g mẫu đất vào bình tam giác 100 mL chứa 50 mL môi trường khoáng tối thiểu (MM) có bổ sung fenobucarb 100 mg/L (Sigma-Aldrich, 96,5%).. - Sau ba lần chọn lọc, 1 mL huyền phù vi khuẩn được pha loãng bằng dung dịch NaCl 9 ‰ đến độ pha loãng 10 -4 . - Vi khuẩn sau khi phân lập thuần được mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào sau ba ngày nuôi cấy trên môi trường TSA.. - 2.2 Xác định khả năng tạo sinh khối của vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung fenobucarb. - Sau 48 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc vi khuẩn xuất hiện trên môi trường TSA. - Chủng một khuẩn lạc riêng lẻ của mỗi dòng vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 4 mL môi trường Trypticase soy broth (15g TSB, 1000 mL nước cất). - Sau đó, mật độ quang của từng dòng vi khuẩn được điều chỉnh về giá trị OD 600nm = 0.8. - Chủng 10 µL huyền phù của mỗi dòng vi khuẩn vào các ống nghiệm có chứa 4 mL môi trường MM lỏng có bổ sung fenobucarb 100 mg/L, nghiệm thức đối chứng có chủng vi khuẩn nhưng không bổ sung fenobucarb. - Sau bảy ngày nuôi cấy, ghi nhận sự tạo thành sinh khối của các dòng vi khuẩn từ đó tuyển chọn các dòng vi khuẩn có sự khác biệt về sinh khối (độ đục) giữa hai nghiệm thức có và không bổ sung fenobucarb để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.. - 2.3 Khảo sát khả năng phân hủy fenobucarb của vi khuẩn. - Chủng một khuẩn lạc (sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA) của mỗi dòng vi khuẩn đã được tuyển chọn từ kết quả của thí nghiệm ở Mục 2.2 vào 2 mL môi trường TSB. - Vi khuẩn được lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 12 giờ. - Chủng 10 µL huyền phù của mỗi dòng vi khuẩn vào các ống nghiệm có chứa 4 mL môi trường MM có bổ sung 100 mg/L fenobucarb. - Mật độ quang (OD 600nm ) của vi khuẩn và hàm lượng fenobucarb còn lại trong môi trường được xác định ở thời điểm và 9 ngày nuôi cấy.. - Sau đó, chuyển 500 µL môi trường MM có chứa vi khuẩn vào eppendorf, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4 o C trong 5 phút. - 2.4 Định danh khoa học các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy hiệu quả fenobucarb. - Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy fenobucarb hiệu quả được cấy trên môi trường TSA, ủ ở 32 o C trong 72 giờ. - Khuẩn lạc của vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường TSB.. - ADN của vi khuẩn được trích bằng phương pháp phenol-chloroform sử dụng bộ iVAaDNA Extraction Kit P (VA.A92-002A) của Công ty cổ phần Việt Á.. - Dựa vào sự tương đồng về trình tự gen 16S- rRNA của vi khuẩn phân lập với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu, các dòng vi khuẩn được khảo sát một số đặc điểm sinh hóa đặc trưng dựa vào khóa phân loại của Bergey để làm cơ sở cho định danh khoa học đến bậc phân loại loài. - 3.1 Vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường có bổ sung fenobucarb. - Từ tám mẫu đất được thu tại tám xã thuộc hai huyện Cờ Đỏ và Vĩnh Thạnh, 20 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường MM có bổ sung fenobucarb (100 mg/L) như nguồn cung cấp carbon duy nhất đã được phân lập. - Năm dòng vi. - Mười lăm dòng vi khuẩn được phân lập trong đất lúa ở huyện Cờ Đỏ có khuẩn lạc tròn. - Tế bào của các dòng vi khuẩn có hình que hoặc hình cầu. - Hình thái khuẩn lạc đại diện của một số dòng vi khuẩn được trình bày ở Hình 1.. - Hình 1: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của một số dòng vi khuẩn đại diện khi được nuôi cấy trên môi trường TSA sau 3 ngày. - 3.2 Sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb. - Trong 20 dòng vi khuẩn phân lập, bốn dòng vi khuẩn CĐ2.3, CĐ5.1, CĐ5.2 và CĐ5.3 được phân lập từ đất trồng lúa ở huyện Cờ Đỏ có khả năng sinh trưởng và tạo sinh khối trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb 100 mg/L, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <. - Tuy nhiên, các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất trồng lúa ở huyện Vĩnh Thạnh không tạo. - sinh khối trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung fenobucarb, chứng tỏ các dòng vi khuẩn này không có khả năng sử dụng fenobucarb.. - Hình thái khuẩn lạc của bốn dòng vi khuẩn tăng trưởng trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb được thể hiện ở Hình 2. - Sự khác biệt về sinh khối của dòng vi khuẩn đại diện CĐ5.3 trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb so với nghiệm thức đối chứng không có bổ sung fenobucarb được thể hiện ở Hình 3.. - Hình 2: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TSA sau 3 ngày nuôi cấy của các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy fenobucarb A: dòng CĐ2.3, B: dòng CĐ5.1, C: dòng CĐ5.2, D: dòng CĐ5.3. - Hình 3: Sự khác nhau về độ đục của dòng vi khuẩn CĐ5.3 sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường MM không bổ sung fenobucarb (A) so. - 3.3 Khả năng phân hủy fenobucarb của vi khuẩn Bốn dòng vi khuẩn CĐ2.3, CĐ5.1, CĐ5.2 và CĐ5.3 được nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb 100 mg/L như là nguồn carbon duy nhất. - 0,05) chứng tỏ cả bốn dòng vi khuẩn đều có khả năng sử dụng fenobucarb để tăng trưởng. - Kết quả phân tích cho thấy hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 có khả năng tạo sinh khối nhanh hơn so với hai dòng vi khuẩn còn lại (Hình 4), do đó hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 được tuyển chọn để khảo sát khả năng phân hủy fenobucarb theo thời gian.. - Hình 4: Mật độ quang của vi khuẩn khi được nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb (100 mg/L) theo thời gian. - Kết quả phân tích sắc ký lỏng cao áp cho thấy khi nuôi cấy các dòng vi khuẩn CĐ2.3, CĐ5.1, CĐ5.2 và CĐ5.3 trong môi trường MM có bổ sung 100 mg/L fenobucarb, hàm lượng fenobucarb giảm đáng kể ở thời điểm 1 ngày nuôi cấy với hiệu suất phân hủy tương ứng là và 32,9%. - Trong thời gian từ 3 đến 9 ngày nuôi cấy, khả năng phân hủy fenobucarb của bốn dòng vi. - Ở thời điểm 9 ngày nuôi cấy, hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 có hiệu suất phân hủy fenobucarb cao hơn hai dòng còn lại, đạt 58,2% và 60,1%, theo thứ tự. - Dòng vi khuẩn CĐ2.3 phân hủy 57,2% và dòng CĐ5.1 phân hủy 55,3% fenobucarb. - Tuy nhiên, khả năng phân hủy fenobucarb của bốn dòng vi khuẩn không khác biệt có ý nghĩa thống kê (Hình 5).. - Hình 5: Hàm lượng fenobucarb còn lại trong môi trường MM có bổ sung fenobucarb (100 mg/L) sau 9 ngày nuôi cấy. - D: dòng CĐ5.3 Theo Kim et al. - (2014), dòng vi khuẩn. - Sphingobium lactosutens DS20 T được phân lập từ đất trồng lúa ở Anseong, Gyeonggi-do, Hàn Quốc có khả năng phân hủy hoàn toàn fenobucarb (100 mg/L) trong 27 giờ và mật độ quang của vi khuẩn tăng dần trong thời gian này. - Trong nghiên cứu này, hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 có khả năng phân hủy với nồng độ ban đầu là 100 mg/L) fenobucarb trong 9 ngày nuôi cấy.. - Như vậy, hai dòng vi khuẩn bản địa CĐ5.2 và CĐ5.3 có khả năng phân hủy fenobucarb chậm hơn và cần thời gian phân hủy dài hơn so với dòng vi khuẩn DS20 T được phân lập từ đất trồng lúa ở Hàn Quốc.. - 3.4 Định danh khoa học các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy fenobucarb hiệu quả. - Hai dòng vi khuẩn phân hủy fenobucarb hiệu quả là CĐ5.2 và CĐ5.3 được giải trình tự gen 16S-. - Đoạn gen 16S-rRNA của dòng CĐ5.2 (1027 nucleotide) được so sánh với gen tương ứng của các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI và có độ tương đồng trên 97% với các loài vi khuẩn thuộc chi Burkholderia như B. - Dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh hóa, dòng CĐ5.2 có khuẩn lạc màu vàng khi nuôi cấy trên môi trường TSA, sau 4-5 ngày sẽ chuyển sang màu tím, Gram âm, có hoạt tính gelatinase, hoạt tính oxidase, có khả năng lên men đường sucrose, glucose và lactose, không phát triển ở nhiệt độ 42 o C, không có hoạt tính urease. - và đặc điểm sinh hóa, dòng vi khuẩn CĐ5.2 được xác định thuộc loài B. - Bảng 1: Các đặc điểm sinh hóa và hình thái của các loài vi khuẩn thuộc chi Burkholderia * có trình tự gen 16S-rRNA tương đồng trên 97% so với gen tương ứng của dòng vi khuẩn CĐ5.2. - Spilker et al.. - Bach et al. - Martina et al. - arboris R-24201 được phân lập từ đất ở Mỹ (Vanlaere et al., 2008). - Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vi khuẩn thuộc chi Burkholderia có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ như methyl parathion, fenitrothion và dicapthon thuộc nhóm thuốc trừ sâu organophosphorus (Fernández-Lópezet al., 2017. - Min et al., 2017). - Nguyen et al., 2019).. - arboris CĐ5.2 thuộc chi Burkholderia lần đầu tiên được chứng minh có khả năng phân hủy thuốc diệt côn trùng fenobucarb thuộc nhóm carbamate. - Như vậy, kết quả nghiên cứu này đã bổ sung thông tin về khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ khác nhau của chi Burkholderia.. - Tương tự, đoạn gen 16S-rRNA của dòng CĐ5.3 (1014 nucleotide) được so sánh với gen 16S-rRNA của các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI và có độ tương đồng trên 97% với các loài vi khuẩn thuộc chi Micrococcus như M. - Dựa vào các đặc điểm về hình thái và sinh hóa, dòng CĐ5.3 có khuẩn lạc màu vàng khi được nuôi cấy trên môi trường TSA, Gram dương, có hoạt tính catalase, hoạt tính gelatinase, không có hoạt tính oxidase, không có. - khả năng phân hủy tinh bột, có khả năng lên men đường sucrose, đồng hóa citrate, không có hoạt tính methyl red và hoạt tính urease. - Trên cơ sở tương đồng về trình tự gen 16S- rRNA, các đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa dòng vi khuẩn CĐ5.3 được xác định thuộc loài M. - Bảng 2: Các đặc điểm sinh hóa và hình thái của các loài vi khuẩn thuộc chi Micrococcus * có trình tự gen 16S-rRNA tương đồng trên 97% so với gen tương ứng của dòng vi khuẩn CĐ5.3. - Dòng CĐ5.3 vàng. - Zhang et al. - terreus V3M1 được phân lập từ đất rừng ở Trung Quốc (Zhang et al., 2010). - Theo Doddamani and Ninnekar (2001), vi khuẩn thuộc chi Micrococcus có khả năng phân hủy thuốc trừ sâu carbaryl thuộc nhóm carbamate. - terreus CĐ5.3 cũng có khả năng phân hủy thuốc diệt côn trùng thuộc nhóm carbamate là fenobucarb. - Như vậy, kết quả của nghiên cứu đã bổ sung thông tin về khả năng phân hủy các loại thuốc BVTV khác nhau thuộc nhóm carbamate của vi khuẩn Micrococcus.. - Từ tám mẫu đất được thu tại hai huyện Cờ Đỏ và Vĩnh Thạnh, Cần Thơ, 20 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung fenobucarb 100 mg/L đã được phân lập.. - Trong đó, bốn dòng vi khuẩn CĐ2.3, CĐ5.1, CĐ5.2 và CĐ5.3 có khả năng tạo sinh khối nhanh sau 7 ngày nuôi cấy. - Hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 có khả năng phân hủy fenobucarb hiệu quả hơn, đạt 58,2% và 60,1% ở thời điểm 9 ngày nuôi cấy. - Dựa vào kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA kết hợp với các đặc điểm hình thái và chỉ tiêu sinh hóa, hai dòng vi khuẩn CĐ5.2 và CĐ5.3 được định danh khoa học lần lượt là Burkholderia arboris CĐ5.2 và Micrococcus terreus CĐ5.3.