- Trình bày các phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase. - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh phytase của chủng vi sinh vật nghiên cứu. - Nghiên cứu enzyme phytase. - Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus amyloliquefaciens. - Tuy nhiên, bổ sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. - 1.3 LÊN MEN XỐP. - Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong quá trình xử lý sinh học môi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức ăn động vật từ các chất thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm.. - Bacillus là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que thuộc ngành Firmicutes, có khả năng sinh nội bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như bầu dục, tròn hay cầu hoặc khúc xạ trụ bên trong tế bào, để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống, đa số các loài vi khuẩn Bacillus là không gây bệnh, tuy nhiên có một số loài được biết đến bởi khả năng gây bệnh cho vật nuôi (như Bacillus anthracis và Bacillus cereus) và gây bệnh cho côn trùng (như Bacillus thuringiensis). - Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an toàn (GRAS) do đó B.. - Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt: môi trường thạch dinh dưỡng NA (g/l): cao thịt- 3;. - Môi trường dịch thể: môi trường NA (g/l): cao thịt-3. - pH 6,8± 0,2, môi trường thạch thường (g/l): cao thịt- 3. - pepton- 5, môi trường thạch thường cải tiến (g/l):. - nước mắm đạm trên 40%- 10ml, môi trường Trypticase soy (hãng BBL), môi trường Jorquera (2008) (g/l): Glucose- 10. - Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media) (g/l): Glucose- 10. - Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase: các môi trường dịch thể sàng lọc vi sinh vật sinh phytase được ký hiệu lần lượt là: K1, K2, G, J, H có công thức lần lượt:. - Môi trường K (g/l): cám gạo-50. - Môi trường K2 (g/l): cám gạo-50. - Môi trường J (g/l): Glucose-10. - Môi trường H (g/l): Glucose- 3. - Môi trường nuôi xốp với cơ chất là ngô vỡ, gạo lức, bột đỗ tương, cám, dung dịch làm ẩm là môi trường dịch thể Jorquera không bổ sung cơ chất Na- phytate).. - 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. - Định tính: Cấy zic zắc các chủng vi khuẩn ưa nhiệt lên môi trường sàng lọc phytase (môi trường PSM) và nuôi ở tủ ấm 37 o C trong 5 ngày, sau khi các khuẩn lạc xuất hiện, tiến hành lấy các khuẩn lạc xuất hiện vòng trong xung quanh. - Chủng nghiên cứu được nuôi lắc trong các môi trường dịch thể có bổ sung Na-phytate kích thích sinh phytase là G, H, J, K1, K2 ở 40 o C, 200 vòng/phút, sau 3 ngày dịch nuôi cấy được ly tâm loại bỏ sinh khối và phần dịch trong được dùng để xác định hoạt tính phytase. - Tiến hành nuôi xốp các chủng vi khuẩn có sinh enzyme phytase trên môi trường gạo lức + dung dịch làm ẩm, sau đó tách chiết dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme để lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao nhất.. - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh trưởng ở chủng nghiên cứu: lựa chọn môi trường nuôi cấy, lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy, pH thích hợp, lựa chọn thời gian nuôi cấy, lựa chọn chế độ thông khí. - Giải trình tự gen mã hóa phytase và so sánh mức độ tương đồng của gen mã hóa phytase chủng SP1901 với gen mã hóa phytase của các loài khác trên genbank sử dụng chương trình Blast và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen mã hóa phytase.. - 3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt tính phytase cao. - trƣởng và vùng phân giải của phytase chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM Định lượng trên môi trường lên dịch thể và lên men xốp: chúng tôi đã tiến hành lên men dịch thể chủng SP1901, D15 để sản xuất phytase trên 5 loại môi trường khác nhau, sau 3 ngày xác định hoạt tính phytase và lên men xốp trên môi trường chứa gạo lức và bột đỗ tương, sau 3,5 ngày mẫu được chiết xuất để xác định hoạt tính phytase.. - Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên dịch thể và lên men xốp. - Hoạt tính phytase Môi trường lên men dịch thể. - (U/ml) Môi trường lên. - men xốp (U/g). - Với các kết quả thu được ở bảng 5 môi trường J cho hoạt tính phytase cao nhất ở cả 2 chủng, tuy nhiên lại thấp hơn nhiều khi so sánh với hoạt tính phytase được sinh ra trên môi trường lên men xốp. - Mặt khác, môi trường J bổ sung cơ chất Na-phytate tinh khiết rất đắt tiền, trong khi đó môi trường lên men xốp sử dụng các cơ chất tự nhiên, dễ kiếm, rẻ tiền do đó chúng tôi quyết định sử dụng lên men xốp cho các nghiên cứu tiếp theo.. - SP1901 và D15 có sinh tổng hợp phytase trên môi trường lên men xốp. - Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính phytase bằng định lượng, thu được kết quả như sau:. - Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60 o C. - Như vậy, chủng SP1901 bền ở 60 o C sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn 90%, trong khi đó chủng D15 hoạt tính chỉ còn 45,7%. - Vì thế chúng tôi lựa chọn chủng SP1901 cho các nghiên cứu tiếp theo.. - Bacillus methylotrophicus_EU194897 Bacillus amyloliquefaciens_NR041455 77. - Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với Bacillus amyloliquefaciens subsp. - trong đó SP1901 sai khác 54 bp với Bacillus amyloliquefaciens subsp. - plantarum FZB42 (tương đương 99%) và sai khác 162 bp với Bacillus amyloliquefaciens subsp. - Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901. - Bacillus amyloliquefaciens subsp. - plantarum FZB42 Bacillus amyloliquefaciens subsp. - Bacillus subtilis subsp. - Môi trƣờng nhân giống thích hợp chủng SP1901. - pH thích hợp cho sinh trƣởng chủng SP1901. - Chế độ thông khí thích hợp cho sinh trƣởng chủng SP1901. - Giống khởi động được dùng để cấy vào các môi trường lên men xốp, đóng vai trò rất quan trọng đối với quá trình lên men xốp sau đó đặc biệt là lượng sinh khối và chất lượng giống. - Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng chủng SP1901. - Thời gian thích hợp cho sinh trƣởng chủng SP1901. - hợp nhất cho chủng SP1901 là nhân giống trên môi trường dịch thể NA ở 40 o C, pH 6 và nuôi trong điều kiện lắc 200 vòng/ phút. - 3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp. - Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901. - Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901. - Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901. - Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901. - Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901. - Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901. - Ảnh hƣởng của hàm lƣợng Ca 2+ đến khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901. - Chủng SP1901 có thể sử dụng nguồn cacbon và nitơ sẵn có trong cơ chất tuy nhiên khi có mặt lactose, glycerol, ure và NH 4 NO 3. - cũng làm tăng nhẹ hoạt tính phytase thu được. - Ion Ca 2+ có vai trò quyết định đối với quá trình sản sinh phytase ở nồng độ thích hợp từ 0,1-1%, các môi trường không có mặt Ca 2+ đều không có sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901.. - 3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901. - Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm 1175 bp, được so sánh độ tương đồng với các chủng thuộc nhóm Bacillus substilis khác đã được công bố trên Genbank. - Cây phân loại được xây dựng dựa vào trình tự của gen phytase của chủng SP1901 và 33 chủng khác thuộc nhóm Bacillus substilis được thể hiện trong hình 28.. - Kết quả ở hình 20 cho thấy chủng SP1901 có độ tương đồng 97% với trình tự gen. - được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase và 6 gen cho thấy: trong cây xây dựng dựa trên 6 gen, vị trí của chủng SP1901 rất gần với 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp.. - amyloliquefaciens DSM7 và Bacillus amyloliquefaciens subsp. - plantarum FZB42, tuy nhiên trong cây dựa trên trình tự gen phytase, vị trí chủng SP1901 chỉ gần với Bacillus amyloliquefaciens subsp. - plantarum FZB42 và xa so với chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp. - Như vậy, có thể thấy rằng trình tự gen phytase của các chủng trong cùng loài Bacillus amyloliquefaciens rất đa dạng và khẳng định thêm kết quả định danh chủng SP1901 đến mức dưới loài là Bacillus amyloliquefaciens subsp. - Bacillus amyloliquefaciens FZB42_CP000560. - Bacillus amyloliquefaciens_FZB45_ AY055220. - Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 HM747163. - Bacillus amyloliquefaciens_AF453255. - Bacillus amyloliquefaciens DSM7_FN597644 Bacillus amyloliquefaciens BAP_AY836773 Bacillus subtilis ATCC 12711_JQ437256. - Bacillus subtilis_AF029053. - Bacillus subtilis_AJ277890. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901. - Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt tính của phytase chủng SP1901. - chủng SP1901. - Ảnh hƣởng của Ca 2+ đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60 o C (phải), xử lý ở 70 o C (trái). - Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho thấy rằng: phytase của chủng bền ở 60 o C (vẫn giữ được 90% hoạt tính sau 30 phút xử lý ở 60 o C), hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50 o C. - Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, sau 30 phút xử lý ở lần lượt 60, 70 và 80 o C hoạt tính phytase giữ được 90, 77 và 49%, sau. - Các chủng này được nuôi trên môi trường PSM, định lượng trên môi trường dịch thể, lên men xốp và kiểm tra khả năng bền nhiệt đã chọn được chủng SP1901 có hoạt tính phytase cao và bền nhiệt.. - Chủng SP1901 được định danh là loài B. - Điều kiện nhân giống thích hợp của chủng SP1901: môi trường thạch thường ở 40 o C, pH 6, điều kiện hiếu khí sau 16-24 h nuôi cấy.. - Điều kiện lên men xốp thích hợp của chủng SP1901 cho hoạt tính phytase cao nhất: cơ. - Phytase của chủng SP1901 bền ở 60 o C, hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50 o C. - Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsine.. - and Bacillus amyloliquefaciens subsp. - Journal of Physiology . - and Bacillus subtilis subsp. - Journal of Bacteriology . - Berkeley RCW (1987), Bacillus amyloliquefaciens sp. - Journal of Nutrition