Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli

- Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E.
- Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người.
- Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người.
- Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E.
- Gen mã hóa.
- những nhu cầu cấp thiết trong điều tri ̣ bê ̣nh Hemophilia , chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E.
- Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người..
- Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người..
- Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI.
- Biểu hiện của bệnh Hemophilia.
- Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau phẫu thuật, có thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường hay bị chảy máu hơn đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp..
- Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX.
- Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein FIX), nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq27.1.
- Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX.
- Vector biểu hiện pET32a.
- Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E.
- Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen..
- Chủng biểu hiện E.
- Tế bào E.
- Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp.
- Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ (prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote)..
- Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây..
- coli BL21(DE3) của hãng Bio-Rad được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX ở người..
- Vector biểu hiện: pET32a (Novagen)..
- Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000133) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình tự như sau:.
- Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F1/R1) để nhân toàn bộ cDNA mã hóa FIX từ mRNA được tách từ mô gan sinh thiết ở người.
- Trong khi biểu hiện, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F4/R5) với mục đích nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide cắt vùng tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N để biểu hiện đoạn cDNA này trong tế bào vi khuẩn E.
- Protein mã hóa từ cDNA được nhân với cặp mồi (F4/R5), kí hiệu là FIX noSP.
- Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX.
- Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE..
- Phân lập gen mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô gan sinh thiết ở người..
- Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIX noSP và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E.
- Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở ngƣời.
- Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ 2 mẫu mô gan sinh thiết bằng phương pháp trizol được điện di biến tính trên gel agarose 1% (Hình 1).
- Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%..
- 1 - 2: Sản phẩm RNA tổng số của 2 mẫu mô gan sinh thiết người..
- được sử dụng làm nguyên liệu cho việc tổng hợp cDNA mã hóa FIX ở người..
- Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa protein FIX của người đã công bố trên Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GENBANK/DDBJ/EMBL (mã số NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX là F1/R1..
- Sản phẩm RT-PCR sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 2).
- Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,4 kb phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của cDNA mã hóa cho FIX..
- Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX.
- 1: Sản phẩm PCR nhân gen FIX..
- Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa protein FIX trong vector pJET1.2.
- Để tạo cơ sở cho thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho FIX, chúng tôi đã tiến hành tạo dòng phân tử sản phẩm RT-PCR (tức là nhân bản chúng trong tế bào chủ dưới dạng một plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA này)..
- Tinh sạch sản phẩm PCR và gắn vào vector tách dòng.
- Sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3).
- Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận các dòng vi khuẩn (2, 4 và 9) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn sản phẩm RT-PCR..
- 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX.
- 2, 3, 4: Sản phẩm xử lý pJET1.2/FIX_p18.
- 5: Sản phẩm xử lý pJET1.2/XbaI + XhoI..
- Như vậy, đoạn cDNA mã hóa cho protein FIX đã được tách dòng thành công trong vector pJET1.2.
- Sau khi phân tích trình tự cả 3 dòng plasmid tái tổ hợp, đoạn cDNA có chiều dài 1386 bp, khung dịch mã được xác định mã hóa yếu tố đông máu IX gồm 461 amino acid kể cả mã kết thúc..
- Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIX noSP ) 3.2.1.
- Khuếch đại cDNA mã hóa FIX noSP.
- Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/FIX_p19 đã được sử dụng làm khuôn để nhân bản gen cần biểu hiện.
- Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa FIX của người công bố trên Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GenBank (NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX noSP là F4/R5.
- Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%..
- Băng sản phẩm PCR sáng, đậm và rõ nét đủ điều kiện cho việc tạo dòng vector tái tổ hợp.
- Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIX noSP.
- 1 : Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX noSP nhân từ khuôn là pJET1.2/FIX (p19)..
- Ghép nối cDNA mã hóa FIX noSP vào vector biểu hiện pET32a.
- Vector pET32a và sản phẩm PCR sau khi được xử lý với hai enzyme hạn chế (NcoI và XhoI) sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản ứng ghép nối với nhau (Hình 6)..
- Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi.
- 1: Sản phẩm PCR (FIX noSP.
- Trên cơ sở kết quả điện di (Hình 6), vector pET32a và cDNA mã hóa FIX noSP được ghép nối với nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase.
- Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIX noSP trong vector pET32a.
- Chúng tôi tiến hành nhặt 5 khuẩn lạc và sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7).
- Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid, chúng tôi thấy cả 5 dòng vi khuẩn (2 3, 4 và 5) đều có kích thước lớn hơn kích thước đối chứng (1).
- Từ đó, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận 5 dòng vi khuẩn này chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA mã hóa FIX noSP.
- Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng.
- 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX noSP .
- 2 - 4: Sản phẩm xử lý pET32a/ FIX noSP với enzyme NcoI + XhoI.
- 5: Sản phẩm xử lý pET32a với enzyme NcoI + XhoI..
- Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid Hình 7, chúng tôi tiến hành lựa chọn 3 trong 5 dòng vi khuẩn này để cắt kiểm tra bằng hai enzyme hạn chế (NcoI và XhoI) để kiểm tra kích thước đoạn chèn (Hình 8).
- Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện pET32a/FIX noSP.
- Kiểm tra độ chính xác trình tự nucleotide của đoạn cDNA mã hóa FIX noSP trong vector tái tổ hợp pET32a/FIX noSP.
- Sau khi phân tích trình tự dòng plasmid tái tổ hợp này, đoạn cDNA mã hóa FIX noSP có kích thước 1302 bp và khung dịch mã được xác định yếu tố đông máu IX với chuỗi polypeptide cắt đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 433 amino acid..
- Như vậy có thể kết luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET32a/FIX noSP mang cDNA mã hóa cho FIX noSP và cấu trúc này đã được chọn dòng trong vi khuẩn E.
- Biểu hiện cDNA mã hóa FIX noSP ở vi khuẩn E.
- Để kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS.
- Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp cho thấy, protein tổng số của các mẫu tế bào ở phân đoạn không tan thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG (các đường chạy từ 4 - 6), có xuất hiện một băng protein mới có khối lượng phân tử khoảng 67 kDa so với mẫu đối chứng sau khi cảm ứng bởi IPTG (các đường chạy từ 1 - 3).
- Như đã trình bày ở trên, ở đây sản phẩm protein lai FIX noSP -Trx biểu hiện sẽ bao gồm trình tự đoạn lai (158 aa) và trình tự FIX noSP (433 aa), tương đương với băng có kích thước khoảng 67 kDa.
- Điện di kết quả biểu hiện protein trên gel polyacrylamide 12,6%..
- Kết quả điện di trên gel acrylamide 12,6% cho thấy protein dung hợp FIX noSP -Trx được biểu hiện tốt nhất ở nhiệt độ 37 o C, 0,5 mM IPTG và thời gian nuôi cấy là 3h sau cảm ứng (Hình 29).
- Các kết quả nhận được cho thấy các điều kiện đã sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp là tương đối phù hợp..
- Từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam khỏe mạnh, chúng tôi đã tách được RNA tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho FIX..
- Đã nhân được đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu ở người (FIX).
- Đoạn cDNA mã hóa FIX có độ dài tương ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid đã được tách dòng và giải trình tự..
- Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a/FIX noSP mang đoạn cDNA mã hóa FIX noSP và biểu hiện được gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX ở E.
- Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa FIX noSP trong vector pET32a ở vi khuẩn E.coli..
- Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin-2 của người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr.
- Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr.
- Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), “Biểu hiện gen interleukin-2 của người rh-IL2MM bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học.
- Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn (2009), “Biểu hiện kháng nguyên CD25 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(3), tr.
- Lê Thu Ngọc (2009), “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin P của vi khuẩn Enterococcus faecium P13 trong tế bào Escherichia coli ER2566”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội..
- “Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây mướp đắng ở vi khuẩn Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(4), tr.
- Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phòng, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Huy Hoàng, Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2010), “Biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (h-tPA) người ở tế bào”, Kỷ yếu hội nghị sinh học phân và hóa sinh y học, tr.
- Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã hóa interleukin-2 của người”, Y học Việt Nam 310(5), tr.
- Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Phạm Đăng Khoa, Tạ Thành Văn (2008), “Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa yếu tố đông máu VIII ở người”, Tạp chí nghiên cứu Y học, tr.
- “Biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người trong tế bào Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 7(1), tr