Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh ở cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb, Saururaceae) tại tỉnh Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người

- DOI:10.22144/ctu.jsi.2019.058 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata THUNB, SAURURACEAE) TẠI TỈNH KIÊN GIANG CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VỚI VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ MỤN NHỌT Ở NGƯỜI Huỳnh Văn Trương 1.
- Bacillus spp., cây diếp cá, kháng khuẩn, mụn nhọt, vi khuẩn nội sinh.
- Nghiên cứu phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh của cây diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt người.
- Cây diếp cá thu ở huyện Phú Quốc, thành phố Hà Tiên và Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang được sử dụng để phân lập vi khuẩn nội sinh.
- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá với Staphylococcus aureus bằng phương pháp tẩm vi khuẩn nội sinh trên giấy lọc và định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA.
- Kết quả cho thấy 60 dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá được phân lập trên môi trường PDA.
- Mười bốn dòng có khả năng kháng được vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người với vòng vô khuẩn từ 10-40 mm.
- Ba dòng vi khuẩn HTT2, PQT4 và RGT2 được nhận diện theo thứ tự là Bacillus amyloliquefaciens strain CD2901, Bacillus megaterium strain 22 và Bacillus subtilis strain B237..
- Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh ở cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb, Saururaceae) tại tỉnh Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người.
- Vi sinh vật nội sinh nói chung và vi khuẩn nội sinh thực vật nói riêng từ lâu đã được biết đến với khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng qua việc cố định đạm, hòa tan dạng lân vô cơ khó tan trong đất, tổng hợp các hormone thực vật (Kumar et al., 2014).
- Trong những năm gần đây, khi vi khuẩn nội sinh được tìm thấy là có thể tổng hợp các dạng kháng sinh tự nhiên có thể kháng lại nhiều vi khuẩn gây bệnh đã kháng thuốc (Christina et al,.
- Điều này cho thấy tiềm năng hứa hẹn về sản xuất kháng sinh tự nhiên từ vi khuẩn nội sinh thực vật và có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh ở thực vật nói chung và cây diếp cá nói riêng.
- Tuy nhiên, việc nghiên cứu chủ yếu trên các hoạt tính của những hợp chất phân lập từ cây và có rất ít nghiên cứu trên vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu.
- Trong hệ vi sinh vật nội sinh cây dược liệu, vi khuẩn nội sinh được biết đến ngoài khả năng hỗ trợ cây sinh trưởng và phát triển tốt, còn có thể sản xuất các hợp chất chuyển hóa có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên.
- Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt là nội dung nghiên cứu đã được thực hiện..
- Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16S rRNA (Lane, 1991) được thiết kế với trình tự sau:.
- 2.4.1 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus.
- Vi khuẩn Staphylococcus aureus được phân lập từ mụn nhọt ở vùng mặt của người qua chọn ngẫu nhiên khi vào Bệnh viện da liễu Cần Thơ để điều trị mụn nhọt trên môi trường thạch máu (BA).
- Sau khi phân lập được và định danh bằng máy định danh tự động VITEK2 cùng các thí nghiệm sinh hóa để định danh vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.
- Sau đó, mẫu được trữ trong thùng lạnh Tại phòng thí nghiệm, mẫu được xử lý và phân lập vi khuẩn theo quy trình sau:.
- 2.4.3 Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây diếp cá.
- 30°C và ghi nhận sự xuất hiện của vòng pellicle, màng mỏng trắng đục, cách bề mặt môi trường từ 2- 4 mm, vòng này chứng tỏ sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh..
- Dung dịch được hút 50 μL của vùng này trải sang môi đường PDA trên đĩa, sau đó được ủ ở 30°C để vi khuẩn phát triển, tiếp tục cấy chuyển vi khuẩn đến khi ròng..
- Độ ròng của vi khuẩn được kiểm tra bằng cách quan sát dưới kính hiển vi..
- Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường PDA đặc tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường..
- 2.4.5 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
- Sau khi phân lập vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2008)..
- 2.4.6 Đo kích thước tế bào vi khuẩn và quan sát chuyển động của vi khuẩn.
- Chuyển động của vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2008)..
- 2.4.7 Nhuộm Gram vi khuẩn.
- Vi khuẩn được nhuộm Gram theo mô tả của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2008).
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn.
- Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.
- 2.4.8 Khảo sát tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn gây bệnh.
- Tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc (Disk diffusion assay) (Bauer et al., 1966) với vi khuẩn Staphylococcus aureus..
- Tiến hành pha loãng và đếm mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Somasegaran and Hoben, 1994).
- Đồng thời, đếm mật số của dòng vi khuẩn gây bệnh.
- Sau khi xác định được mật số của các dòng vi khuẩn gây bệnh, tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội.
- Dòng vi khuẩn gây bệnh được nuôi cấy trên môi trường PDA và được điều chỉnh mật số 10 8 CFU/mL..
- Bố trí thí nghiệm dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus..
- 2.4.9 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh được đánh giá theo quy ước của Galindo (2004).
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Staphylococcus aureus(S.
- Hình 2: Vi khuẩn S.
- Vi khuẩn S.
- aureus phân lập từ mụn nhọt người là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho.
- aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi (Hình 2)..
- 3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh cây diếp cá.
- Sáu mươi dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá được phân lập trên môi trường PDA.
- Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn có dạng tròn hoặc không đều, màu trắng hoặc màu vàng.
- Tất cả các dòng vi khuẩn có dạng hình que, gram dương có một số dòng di động.
- Vi khuẩn có dạng hình que..
- Hình 3: Vi khuẩn nội sinh cây diếp cá chụp qua kính hiển vi SEM.
- 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh cây diếp cá với vi khuẩn S.
- Sáu mươi dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá khảo sát hoạt tính kháng khuẩn với S.
- aureus thu được 14 dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S.
- Hình 4: Vòng vô khuẩn khi khảo sát tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh 3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
- Kết quả có 14 dòng trong 60 dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá có khả năng kháng được.
- Vi khuẩn nội sinh cây diếp cá.
- Hình 5: Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của 14 dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn với S.
- 3.3.2 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá.
- Trong mười bốn dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus thì có 3 dòng có hoạt tính.
- Hình 6: Đường kính (mm) vòng vô khuẩn của HTT2, RGT2 và PQT4 có hoạt tính kháng khuẩn với S..
- aureus 3.4 Kết quả định danh dòng vi khuẩn triển vọng.
- Ba dòng vi khuẩn HTT2, RGT2 và PQT4 được nhận diện lần lượt là Bacillus amyloliquefaciens.
- Bảng 2: Kết quả giải trình tự của 03 dòng vi khuẩn nội sinh.
- STT Dòng vi khuẩn Kết quả nhận diện Độ tương đồng.
- So sánh trình tự của dòng HTT2 với trình tự các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI thì đoạn DNA của dòng HTT2 dài 1.230 bp có tỷ lệ đồng hình 97% với trình tự DNA của Bacillus amyloliquefaciens strain CD2901.
- Vi khuẩn B.
- Dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá.
- (2013) cho biết dòng vi khuẩn B..
- plantarum SP 1901 có khả năng kháng các loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm gây bệnh trên người như S.
- amyloliquefaciens R3 cũng có khả năng kháng E.
- amyloliquefaciens VJ-1 kháng được vi khuẩn B.
- Kết quả so sánh trình tự của dòng PQT4 với trình tự các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI thì đoạn DNA của dòng PQT4 dài 1.290 bp có tỷ lệ đồng hình 97% với trình tự DNA của Bacillus megaterium strain 22.
- megaterium là vi khuẩn hình que, Gram dương có bào tử.
- megaterium được xem như một loại vi khuẩn hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí khi cần thiết, là một trong những loại vi khuẩn có kích thước lớn nhất được tìm thấy trong đất cát nên vì thế được gọi là “mega”.
- năng ức chế các dòng vi khuẩn Salmonella typhimurium, S.
- Kết quả so sánh trình tự của dòng RGT2 với trình tự các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI thì đoạn DNA của dòng RGT2 dài 1.120 bp có tỷ lệ đồng hình 96% với trình tự DNA của Bacillus subtilis strain B237.
- Chi Bacillus là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống.
- Vi khuẩn Bacillus sensu lato có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn, bao gồm các kháng sinh peptide và lipopeptide và bacteriocin (Stein, 2005)..
- (2014) đã thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn cô đặc và dịch ly tâm không có vi khuẩn của dòng B.
- subtilis RLID kết quả dịch ly tâm không có vi khuẩn của dòng B..
- subtilis RLID 12.1 có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm là E.
- coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Acinetobacter baumannii và Yersinia aldovae, vi khuẩn Gram dương là Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes và Enterococcus faecalis và các loại nấm gây bệnh như: C.
- Dịch tế bào vi khuẩn cô đặc của dòng B.
- subtilis RLID 12.1 có khả năng kháng 28 dòng vi khuẩn được nghiên cứu.
- subtilis MIR 15 có thể kháng lại vi khuẩn P..
- subtilis có khả năng kháng lại E.
- subtilis (B7, B9, B15) với các vi khuẩn gây bệnh và nấm trong quá trình lên men Parkia biglobosa để sản xuất Soumbala.
- Kết quả dòng B15 có khả năng kháng S.
- dòng B7 có khả năng kháng S.
- (2007) nhận thấy khả năng kháng khuẩn của lipopeptide được sản xuất bởi B.
- (2014) phân lập các dòng Bacillus từ màng kết của mắt và thử khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh mắt, kết quả B.
- subtilis LFB112 từ thảo dược ở Trung Quốc có khả năng sản xuất hợp chất kháng khuẩn được xác định là bacteriocin, chất này có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương như E.
- Sáu mươi dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá được phân lập từ lá, thân và rễ thu huyện Phú Quốc, thành phố Hà Tiên và Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang Trong đó, mười bốn dòng có khả năng kháng được vi khuẩn Staphyloccocus aureus từ mụn nhọt ở người với vòng vô khuẩn từ 10-40 mm.
- Ba dòng vi khuẩn nội sinh cây diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao HTT2, PQT4 và RGT2 được nhận diện theo thứ tự là Bacillus amyloliquefaciens strain, Bacillus megaterium strain 22 và Bacillus subtilis strain B237..
- Sách chuyên khảo vi khuẩn nội sinh thực vật.
- Đặc điểm sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp