- PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN DÒNG VI KHUẨN CHỊU NHIỆT CAO CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA SÚC - GIA CẦM. - Bacillus megaterium, lông gia súc, lông gia cầm, vi khuẩn chịu nhiệt. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy mạnh các cơ chất chứa keratin từ lông gia súc-gia cầm. - Có 54 dòng vi khuẩn hiếu khí chịu nhiệt đã được phân lập từ 18 mẫu đất và hai mẫu nước thu được tại các lò giết mổ ở ba tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long và Kiên Giang. - Với 54 dòng có khả năng phát triển và phân hủy keratin ở 45 o C. - Các mẫu được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ để phân lập và khảo sát khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin của vi khuẩn. - Đa số các dòng vi khuẩn được phân lập có khuẩn lạc màu trắng đục hoặc vàng nhạt, bìa nguyên với 23 dòng tế bào hình que và 31 dòng hình cầu (42 dòng Gram âm và 12 dòng Gram dương). - Trong đó dòng KG2 thể hiện khả năng phân hủy keratin mạnh nhất ở 55 o C với kết quả phân hủy lông gia cầm là 57,91%. - kết quả phân hủy lông gia súc là 35,06%. - Phân lập và nhận diện dòng vi khuẩn chịu nhiệt cao có khả năng phân hủy lông gia súc - gia cầm. - Tuy nhiên một số loài vi khuẩn vẫn có khả năng phân giải keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính của enzyme keratinase (Onifade et al.,1998). - Nhiều dòng vi khuẩn phân hủy keratin được phân lập từ đất và nước thải. - Các dòng vi khuẩn Gram âm cũng có khả năng phân hủy keratin. - Trong đó có Chyseobacterium indologenes có khả năng phân hủy lông vũ trong quá trình nuôi cấy (Tam et al., 2014). - Keratinase từ vi khuẩn có ứng dụng quang trọng trong các quy trình sinh học liên quan đến chất thải chứa keratin từ ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm. - Hướng xử lý mới cho nguồn chất thải này là sử dụng các dòng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase có hoạt tính cao. - trình xử lý, nhiệt độ trong quá trình phân hủy có thể tăng cao gây ức chế hoạt động của các dòng vi khuẩn phân hủy nguồn chất thải này. - Nhận diện các dòng vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp sinh học phân tử: DNA của vi khuẩn được ly trích và khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R. - Khảo sát khả năng chịu nhiệt của các dòng vi khuẩn bằng cách cấy các khuẩn lạc đã ròng sang môi trường bột lông và ủ lần lượt ở nhiệt độ 50 o C. - Các dòng vi khuẩn sống sót ở nhiệt độ 50 o C sẽ được cấy sang môi trường bột lông và tiếp tục ủ ở nhiệt độ 55 o C. - 2.2.2 Đánh giá khả năng phân hủy lông gia súc - gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 50 o C. - Đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 50 o C: từng dòng vi khuẩn đã phân lập phát triển ở 50 o C được nuôi trong môi trường tăng sinh khối (môi trường có bổ sung bột lông vũ như trên nhưng không chứa agar) đến khi đạt mật số khoảng 10 11 tế bào/mL. - Hút 4 mL dịch vi khuẩn cho vào bình tam giác chứa 96 mL môi trường như trên và lắc 120 vòng/phút ở 50 o C trong 7 ngày. - Đánh giá khả năng phân hủy lông gia súc của các dòng vi khuẩn ở 50 o C: thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên nhưng lông gia cầm được thay bằng lông gia súc.. - 2.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy lông gia súc - gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 55 o C. - Đánh giá khả năng phân hủy lông gia súc - gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 55 o C: thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên nhưng thay đổi nhiệt độ.. - 2.2.4 Nhận diện dòng vi khuẩn chịu nhiệt bằng phương pháp sinh học phân tử. - Một dòng vi khuẩn chịu nhiệt và có khả năng phân hủy lông gia súc-gia cầm mạnh nhất được tuyển chọn giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, đối chiếu với dữ liệu trên Genbank bằng công cụ BLAST để xác định mức độ tương đồng về trình tự của đoạn gen này với các dòng vi khuẩn đã được. - Quy trình được thực hiện như sau: ly trích DNA của vi khuẩn. - thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R dùng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn (Yang et al., 2008) có trình tự sau:. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn. - Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập được. - Từ 20 mẫu (18 mẫu đất và hai mẫu nước) được thu được tại 18 cơ sở giết mổ gia súc – gia cầm ở các tỉnh Vĩnh long, Kiên Giang và thành phố Cần Thơ đã phân lập được 54 dòng vi khuẩn hiếu khí phát triển được ở 45 o C. - Tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng phát triển trên môi trường bột lông vũ, chứng. - Sau khi phân lập ròng, các dòng vi khuẩn được cấy trên môi trường đặc có cùng thành phần để quan sát hình thái khuẩn lạc. - để tế bào vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập từ 24-48h. - Đặc điểm về hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được mô tả trong Bảng 1.. - Hình 1: Hình thái khuẩn lạc của dòng KG5 và KG9 Trong 54 dòng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập được. - 31 dòng vi khuẩn có dạng hình cầu, kích thước. - Một số dòng vi khuẩn được phân lập có hình thái và kích thước thể hiện ở Bảng 2.. - Bảng 2: Đặc điểm hình thái và kích thước tế bào của một số dòng vi khuẩn được phân lập. - 3.2 Khả năng phân hủy lông gia súc - gia cầm của các dòng vi khuẩn. - 55 o C thì kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân hủy keratin qua việc phân hủy bột lông gia súc - gia cầm, khác biệt ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng (không chủng vi khuẩn). - Trong đó dòng KG2 thể hiện khả năng phân hủy lông mạnh hơn so với các dòng KG22, KG23, KG26 và VL2 ở 55 o C với kết quả phân hủy lông gia súc, gia cầm lần lượt là 35,06%. - Kết quả này cao hơn kết quả của các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất và nước tại trại chăn nuôi gia súc-gia cầm trong nghiên cứu của Quách Thị Thanh Tâm và ctv. - (2014) cho hiệu quả phân hủy sau 7 ngày ủ lắc ở 55 o C.. - Tuy nhiên kết quả này thấp hơn kết quả của các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất và lông vũ trong nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng và ctv. - Thành phần môi trường và nhiệt độ là hai yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến sự tổng hợp enzyme keratinase của vi khuẩn. - Vì vậy cần xác định nhiệt độ tối ưu của enzyme keratinase của mỗi dòng vi khuẩn phân lập.. - 3.2.1 Khả năng phân hủy lông gia súc của các dòng vi khuẩn. - Khả năng phân hủy lông gia súc của các dòng vi khuẩn ở 50 o C. - Kết quả từ Bảng 3 và Hình 2 cho thấy dòng VL2 cho kết quả phân hủy bột lông gia súc mạnh hơn các dòng vi khuẩn còn lại với kết quả phân hủy là 53,73% (khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng còn lại trong nhóm). - Các dòng vi khuẩn còn lại cũng có khả năng phân hủy bột lông gia súc tương đối tốt như KG2, KG30, CT5, KG22, KG23, trong đó thấp nhất là dòng KG26 với khả năng phân hủy 24,56%. - Kết quả này cho thấy khả năng phân hủy lông gia súc-gia cầm của các dòng vi khuẩn chịu sự ảnh hưởng của nhiệt độ. - Ở nhiệt độ 50 o C thì dòng VL2 vi khuẩn. - phân hủy lông hiệu quả hơn dòng Kr11 ở 37 o C. - Bảng 3: Khả năng phân hủy bột lông gia súc của 18 dòng vi khuẩn sau một tuần nuôi lắc ở 50 o C STT Dòng Khả năng phân hủy. - STT Dòng Khả năng phân hủy. - Hình 2: Khả năng phân hủy bột lông gia súc của 18 dòng vi khuẩn sau một tuần nuôi lắc ở 50 o C b. - Khả năng phân hủy lông gia súc của các. - dòng vi khuẩn ở 55 o C. - Kết quả từ Bảng 4 cho thấy nhóm vi khuẩn khảo sát ở 55 o C cũng cho kết quả phân hủy bột lông gia súc khá tốt. - Trong đó dòng VL2 phân hủy lông gia. - Dòng KG26 có kết quả phân hủy thấp nhất 20,77%.. - Bảng 4: Khả năng phân hủy bột lông gia súc của 5 dòng vi khuẩn sau một tuần nuôi lắc ở 55 o C STT Dòng Khả năng phân hủy. - 3.2.2 Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn. - a.Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 50 o C. - Kết quả từ Bảng 5 và Hình 3 cho thấy một số lượng đáng kể bột lông gia cầm đã bị phân hủy bởi các dòng vi khuẩn phân lập được và đã hòa tan vào dung dịch. - Dòng VL12 cho khả năng phân hủy tốt nhất trong các dòng phân lập được với 72,97%. - lượng bột lông bị phân hủy sau 7 ngày nuôi lắc.. - (2009) đã phân lập dòng vi khuẩn Bacillus phân hủy 90% lông sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trường lỏng chỉ toàn bột lông ở 30 o C, và các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất và lông vũ của Nguyễn Huy Hoàng và ctv.. - Nhưng nghiên cứu này khảo sát khả năng phân hủy lông ở nhiệt độ 50 o C.. - Bảng 5: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của 18 dòng vi khuẩn sau một tuần nuôi lắc ở 50 o C STT Dòng Khả năng phân hủy. - Hình 3: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của 18 dòng vi khuẩn sau một tuần nuôi lắc ở 50 o C c. - Khả năng phân hủy lông gia cầm của các. - Dòng KG26 có kết quả phân hủy thấp nhất 37,12%.. - Bảng 6: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của 5 dòng vi khuẩn sau một tuần nuôi lắc ở 55 o C STT Dòng Khả năng phân hủy. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy lông gia súc-gia cầm của các dòng vi khuẩn cho thấy khả năng phân hủy lông gia cầm cho hiệu quả cao hơn khả năng phân hủy lông gia súc (Hình 4) hầu như ở tất cả các dòng vi khuẩn tương ứng, mặc dù chúng được phân lập từ các lò giết mổ gia súc-gia cầm. - Đều này cho thấy khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin không chỉ phụ thuộc vào dòng vi khuẩn và hoạt độ. - Sự khác biệt khả năng phân hủy lông gia súc và gia cầm của các dòng vi khuẩn cũng có thể là do sự khác biệt về cấu trúc keratin giữa lông gia súc -keratin và lông gia cầm. - Hình 4: Khả năng phân hủy bột lông gia súc, gia cầm của các dòng vi khuẩn sau 7 ngày lắc ủ ở 55 o C 3.3 Nhận diện một số dòng vi khuẩn chịu. - nhiệt bằng phương pháp sinh học phân tử Dựa vào kết quả khảo sát khả năng phân hủy keratin qua việc khảo sát kết quả phân hủy bột lông gia súc-gia cầm. - Đồng thời dựa vào khả năng chịu nhiệt của các dòng vi khuẩn phân lập được thì dòng. - DNA của dòng vi khuẩn được ly trích và khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R. - Kết quả điện di sản phẩm PCR của dòng vi khuẩn KG2 cho thấy đã khuếch đại thành công đoạn gene với kích thước khoảng 1.500bp (Hình 5).. - Dòng vi khuẩn KG2 có kết quả giải trình tự 16S rDNA (Hình 6).. - Như vậy, dòng vi khuẩn được tuyển chọn từ nghiên cứu này thuộc chi Bacillus. - Kết quả này phù hợp với kết luận của Ghosh et al., (2007) là phần lớn các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy keratin cao phân lập đều thuộc chi Bacillus. - Các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus đã được nghiên cứu khá nhiều và chứng tỏ được khả năng phân hủy cơ chất keratin.. - Trong nghiên cứu này, từ 20 mẫu đất và nước thu tại 3 tỉnh Vĩnh Long, Kiên Giang và thành phố Cần Thơ đã phân lập được 54 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường bột lông vũ. - Phần lớn các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, màu trắng trong, độ nổi mô và bìa nguyên, kích thước khuẩn lạc dao động từ 0,5 mm đến 6 mm. - Trong 54 dòng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập có 23 dòng có dạng hình que, kích thước của các dòng dao động với chiều dài từ 0,57 µm đến 5,82 µm. - 31 dòng vi khuẩn có dạng hình cầu, kích thước của các dòng dao động từ 0,68 µm đến 1,35 µm. - Tất cả 54 dòng vi khuẩn đều phát triển ở nhiệt độ 45°C. - Sau đó khảo sát sự phân hủy lông cho thấy các dòng vi khuẩn phân hủy bột lông gia cầm từ 37,12% đến 72,97%. - Dòng vi khuẩn KG2 cho thấy. - khả năng phân hủy lông gia súc-gia cầm mạnh hơn các dòng còn lại và có khả năng chịu được nhiệt độ cao. - Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn có khả năng phân giải keratin dùng để chuyển hóa sinh học lông gia cầm. - Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản.. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc gia cầm từ các lò mổ gia súc ở ba huyện Tam Bình, Long Hồ và Vũng Liêm tỉnh Vĩnh Long. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân giải keratin từ chất thải chăn nuôi ở Đồng Tháp