- MỞ ĐẦU Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu. - Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu. - Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm. - Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ.. - Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa. - Chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi” với định hướng đưa ra được các giải pháp công nghệ để sản xuất các chế phẩm nói trên bằng các nguyên liệu trong nước. - Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. - Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). - Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. - Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”. - (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.. - Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi. - Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. - Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh [36]. - Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). - Theo thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. - Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). - Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày. - Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. - Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994). - Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005). - Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật ruột. - coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90. - Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. - Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật. - đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột. - cũng như kiểu và tần số nhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. - Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại. - Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng. - Trạng thái Eubiosis - Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh - Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm.. - Trạng thái Dysbiosis - Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi sinh vật đường ruột. - Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ. - Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng. - Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. - Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí bám dính. - Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E. - Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển.. - Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một số axit hữu cơ khác. - Cạnh tranh chất dinh dưỡng: các sinh vật probiotic cạnh tranh với các vi sinh vật gây bệnh các chất dinh dưỡng quan trọng.. - Cạnh tranh loại trừ: các sinh vật probiotic khóa chặt các vị trí thụ cảm do đó loại trừ được các vi sinh vật gây bệnh. - Màng chắn: nơi các sinh vật probiotic chiếm giữ các thụ cảm trên bề mặt ruột, độc tố được loại trừ. - Gây bệnh: các vi sinh vật gây bệnh và chất độc của chúng bám vào niêm mạc và các thụ cảm trên ruột và phá hủy chúng. - Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, ngăn cản sự bám dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. - Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. - Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ruột (Cebra, 1999). - Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic. - Lựa chọn các chủng probiotic Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh (colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ. - Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau. - Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ. - Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác.. - Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này. - Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic. - Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae.. - Sinh axit hữu cơ, kích thích tiêu hoá - Hấp thu chất độc và cạnh tranh dinh dưỡng, vị trí bám trên biểu mô với vi sinh vật gây bệnh.. - Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau.. - Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic. - Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật. - Điều này cho thấy là yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật nuôi, con người và môi trường. - Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và động vật, không mang gen lạ. - Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được khuyến cáo sử dụng. - Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. - Phân loại vi sinh vật. - Yêu cầu tiên quyết là các chủng vi sinh vật probiotic phải được định danh chính xác đến chi (genus) và loài (species) (FAO, 2002). - Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại KIT định danh vi sinh vật khác nhau như API 50CH, API-20E. - Tuy nhiên các KIT này được phát triển dựa trên các đặc tính sinh lý và sinh hoá của các vi sinh vật đã biết, vì vậy với yêu cầu định danh chính xác cần kết hợp các đặc tính phân loại về hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử. - Những nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Savage (1987). - Bằng kỹ thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotic (Patterson và ctv, 2003). - Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotic. - Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và ctv, 2003). - Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự axit nucleic trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều nước trên thế giới. - Lê Thanh Bình và ctv (1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99. - Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g). - Nguồn vi sinh vật - Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích từ các nguồn khác nhau: chất chứa trong đường tiêu hóa của lợn, gà. - Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Shigella sp., Salmonella sp… từ Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC. - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội. - Máy móc và dụng cụ Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC. - Định tính axit lactic Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp đục lỗ. - Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D.. - Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày. - Cấy vi sinh vật, sau 2 -3 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng được tuyển chọn.. - Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật. - Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có pH = 7,0, trong máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 30. - Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật. - Tương tự như trên, các chủng vi sinh vật cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có độ pH khác nhau (2. - Ảnh hưởng của môi trường có nồng độ muối mật khác nhau đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật. - Các chủng vi sinh vật probiotic được nuôi riêng rẽ trên môi trường dịch thể phù hợp cho từng vi sinh vật chứa nồng độ muối mật thay đổi (0,2. - Sau 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được đánh giá: với vi khuẩn (thông qua mật độ quang OD660). - Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật vào niêm mạc đường tiêu hóa · Chuẩn bị vi khuẩn và nấm men probiotic. - Đánh giá tính tương thích của các chủng vi sinh vật với một số thành phần có hoạt tính trong khẩu phần ăn.. - Phát triển chế phẩm probiotic Các chủng vi sinh vật probiotic được sử dụng để phát triển chế phẩm dạng bột theo nghiên cứu trước đây (Trần Quốc Việt và cs, 2007).. - Mật độ các chủng vi sinh vật hữu ích đạt 107 – 108 cfu/g.. - Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích. - Vi sinh vật probiotic chủ yếu là vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycess boulardii. - Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật tồn tại trong đường tiêu hoá của vật nuôi (gà, lợn) và một số nguồn khác nhau (đất, các sản phẩm lên men). - Việc lấy mẫu phân lập sẽ có nhiều khả năng thu nhận và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có đặc tính probiotic như chịu axit, muối mật, sinh enzym thuỷ phân và bacteriocin kháng khuẩn gây bệnh. - Từ các nguồn khác nhau, 254 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó có 164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus và 45 chủng nấm men (bảng 4).. - Bảng 4: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau. - Nhóm vi sinh vật đã phân lập. - Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được giữ trong ống nghiệm môi trường (MRS, thạch thường và YM) thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. - Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic 3.2.1