- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ DƯA LÊ NON (Cucumis melo L.) MUỐI CHUA. - Dưa lê non muối chua, kháng khuẩn, tuyển chọn, vi khuẩn acid lactic, vi khuẩn chỉ thị. - Nghiên cứu được thực hiện với mục đích phân lập các dòng vi khuẩn lên men lactic hiện diện trong dưa lê non (Cucumis melo L.) muối chua và tuyển chọn dòng có khả năng kháng khuẩn cao. - Vi khuẩn acid lactic (LAB) được phân lập từ các mẫu dưa lê non muối chua ở các ngày lên men khác nhau. - Kết quả đã phân lập được 19 dòng có khuẩn lạc trắng đục hoặc trắng ngà, tế bào hình que, hình cầu đơn hoặc chuỗi, Gram dương, không di động, catalase và oxidase âm tính, có vùng phân giải rõ và phát triển trên môi trường MRS có bổ sung CaCO 3 . - Trong đó, 9 dòng có khả năng sinh bacteriocin kháng 4 dòng vi khuẩn chỉ thị (Bacillus subtilis. - Các dòng có đường kính vòng kháng khuẩn lớn và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các dòng khác là dòng L22, L61, L64 và L123. - Tiến hành định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, sử dụng kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA, dòng L22 được xác định là Pediococcus acidilactici, ba dòng vi khuẩn L61, L64 và L123 có mức độ tương đồng trên 99% về trình tự gen 16S rRNA lần lượt với các dòng Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum và Lactobacillus brevis.. - Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ dưa lê non (Cucumis melo L.) muối chua. - Muối chua rau quả là biện pháp bảo quản truyền thống được sử dụng nhiều ở các nước. - Ở Việt Nam, các loại rau muối chua thường được sản xuất theo quy. - mô thủ công tại gia đình, quá trình lên men được thực hiện trong điều kiện tự nhiên nên chất lượng sản phẩm thường không ổn định, các thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình lên men chưa được xác định rõ. - Đến nay chưa có nghiên cứu công bố về sự hiện diện của vi khuẩn lactic trong sản phẩm dưa lê muối chua sau quá trình lên men. - Vì vậy, việc phân lập và xác định loài vi khuẩn tham gia vào quá trình chuyển hóa đường từ loại nguyên liệu dưa lê là cần thiết nhằm cung cấp và bổ sung thông tin khoa học về sản phẩm rau quả lên men lactic này.. - Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard et al., 1997).. - Điều này đã cho thấy khả năng ứng dụng nguồn LAB được phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống vào việc chế biến và bảo quản thực phẩm vì có khả năng sinh bacteriocin cao. - Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và nhận diện nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ dưa lê muối chua, nhằm cung cấp và bổ sung thông tin khoa học về sản phẩm rau quả lên men lactic này.. - Mẫu dưa lê non được thu hoạch từ khu thực nghiệm nông nghiệp, Bộ môn Khoa học cây trồng, Trường Đại học Cần Thơ. - Bốn dòng vi khuẩn gây bệnh được sử dụng trong nghiên cứu gồm hai vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli – ATCC 25922 , Salmonella enteritidis – ATCC 13076). - hai vi khuẩn Gram dương (Staphylococus aureus – ATCC 25923, Bacillus sultilis – ATCC 25924).. - 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị dưa lê non muối chua. - Mẫu dưa lê được xử lý sơ bộ (cắt bỏ cuống, loại bỏ cánh hoa còn sót lại), lựa chọn trái có khối lượng nằm trong khoảng từ 80÷150 g/trái và đem chần ở nhiệt độ 75°C trong thời gian 3 phút. - Sau đó, dùng nước sạch để làm nguội, để ráo và cho dưa lê non vào dụng cụ lên men. - Tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng (30±2°C) với thời gian lên men 12 ngày (Nguyễn Văn Mười và ctv., 2013).. - Thành phần hóa lý ban đầu của dưa lê non và sản phẩm muối chua (sau 12 ngày lên men) được xác định theo các phương pháp tiêu chuẩn, bao gồm độ ẩm. - 2.2.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ dưa lê non muối chua. - Quá trình lên men lactic từ rau quả gồm 3 giai đoạn đầu, giai đoạn chuyển hóa chính và giai đoạn kết thúc quá trình lên men khi pH sản phẩm đạt từ 3,3÷3,5. - Các mẫu muối chua bao gồm dưa lê và dịch lên men ở các ngày lên men thứ và 12 (kết thúc quá trình lên men), được xay nhuyễn bằng máy xay mẫu để đồng nhất mẫu. - Xác định các đặc điểm ban đầu về hình thái, màu sắc của vi khuẩn hiện diện (Arimah et al., 2014). - Vi khuẩn lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính và phân giải được CaCO 3 (Abee et al., 1999;. - 2.2.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao. - Dòng 10% dung dịch vi khuẩn này vào môi trường nước mắm - peptone 2% agar ở 50°C và tiến hành đổ đĩa. - Những dòng vi khuẩn lactic đã phát triển trong 2 mL MRS lỏng dưới điều kiện yếm khí trong 48 giờ, ly tâm 8.000 rpm trong 15 phút ở 4°C. - Thu được dung dịch có khả năng có bacteriocin thô. - Lấy 80 µL dung dịch bacteriocin thô nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã chứa dòng vi sinh vật chỉ thị. - Sau đó, đĩa được ủ ở 37°C cho vi khuẩn chỉ thị phát triển.. - Hoạt tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn.. - So sánh, chọn lựa các dòng vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra đường kính vòng kháng khuẩn ở mức trung bình và cao đối với 4 dòng vi sinh vật chỉ thị (Hwanhlem et al., 2011), cụ thể:. - Bacillus sultilis: đường kính vòng phân giải từ 5 mm thể hiện có khả năng kháng khuẩn.. - 2.2.4 Định danh dòng vi khuẩn lactic bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA. - Xác định loài của dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng kháng khuẩn cao nhất bằng kỹ thuật sinh học phân tử, sử dụng kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA với cặp mồi (của Hoa Kỳ).. - Sử dụng phần mềm Blast N để so sánh tương đồng giữa các dòng vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu NCBI.. - 3.1 Thành phần hóa lý cơ bản của dưa lê non Thành phần nguyên liệu là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm muối chua. - Bảng 1: Thành phần hóa lý cơ bản của dưa lê non trước và sau lên men. - ban đầu Sau lên men Độ ẩm. - Kết quả phân tích ở Bảng 1 cho thấy, dưa lê có độ ẩm trung bình cao, đạt giá trị 93,17%. - Hàm lượng acid toàn phần của dưa lê thấp từ hàm lượng acid này phù hợp cho sự phát triển ban đầu của nhóm vi khuẩn lactic (Battcock and Azam-Ali, 2001). - Hàm lượng đường trong dưa lê non là 1,73% và đủ cho sự hoạt động của nhóm vi khuần latic. - Theo Trần Minh Tâm (1998), lượng đường thích hợp cho muối chua rau quả vào khoảng 1,5÷3%. - Nhìn chung, thành phần hóa học của dưa lê tương đối thích hợp cho quá trình muối chua. - Sau 12 ngày lên men trong dung dịch 4% NaCl đã tạo sản phẩm có chất lượng tốt với màu sắc, hương vị đặc trưng, độ giòn cao hơn các sản phẩm lên men cùng loại, điều này cho thấy có sự hoạt động tốt của các vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình lên men. - Việc phân lập các dòng vi khuẩn lactic hiện diện tham gia vào quá trình muối chua dưa lê non cần được thực hiện.. - 3.2 Phân lập các dòng vi khuẩn lactic hiện diện Kết quả đã phân lập được 19 dòng vi khuẩn với các đặc điểm như vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, không phản ứng indole,. - sinh acid lactic và phân giải CaCO 3 , catalase và. - a) Thử tinh bột b) Vòng phân giải casein c) Vòng phân giải pectin Hình 1: Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân giải của dòng vi khuẩn đã phân lập Bảng 2: Đặc điểm hình thái của các dòng vi. - khuẩn phân lập Ngày. - lên men Dòng phân. - lập Hình thái tế bào vi khuẩn. - Kết quả ở Bảng 2 cho thấy các khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn có dạng hình que ngắn hay dài,. - có một số vi khuẩn hình cầu đơn, kết đôi xếp thành chuỗi. - Kết quả khảo sát các đặc tính sinh lý sinh hóa cho thấy, các dòng vi khuẩn sau khi tuyển chọn sơ bộ đều mang các đặc điểm: không di động, không sinh bào tử, không phản ứng indole, sinh acid lactic và phân giải CaCO 3 , catalase và oxidase âm tính (Đỗ Thị Tuyết Nhung và ctv., 2014;. - Ngoài ra, các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả dương tính với amylase nên có khả năng phân giải tinh bột, không có phản ứng chuyển sang màu xanh tím khi nhỏ dung dịch lugol vào môi trường nuôi tăng sinh chứa tinh bột. - Khả năng phân giải casein và pectin được khảo sát bằng phương pháp đục lỗ môi trường thạch đĩa (Hình 1).. - Sau 48 giờ nuôi cấy, sự phát triển của vi khuẩn lactic trên môi trường có bổ sung các cơ chất khác nhau đã tạo thành vòng phân giải xung quanh lỗ đục, điều này khẳng định vi khuẩn lactic phân lập được đều có khả năng phân giải casein và pectin.. - 3.3 Khả năng kháng với vi khuẩn chỉ thị và sinh enzyme ngoại bào. - Kết quả kháng vi khuẩn chỉ thị của các dòng vi khuẩn lactic phân lập từ một số sản phẩm lên men được thể hiện ở Bảng 3.. - Bảng 3: Vòng kháng vi khuẩn chỉ thị của các dòng vi khuẩn lactic Dòng phân lập E. - Kết quả từ Bảng 3 cho thấy, trong 19 dòng vi khuẩn phân lập, có 9 dòng thể hiện tính kháng khuẩn với cả 4 dòng vi sinh vật chỉ thị. - Trong đó, dòng L123 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với các dòng vi sinh vật chỉ thị, cụ thể đối với Salmonella enteritidis, L123 thể hiện đường kính vòng phân giải >. - 20 mm) đối với Staphylococus aureus, 17,32 mm trong trường hợp kháng hoạt động của Bacillus sultilis và thuộc nhóm kháng khuẩn trung bình đối với Escherichia coli (35,36 mm), kế đến là L61, L22 và L64. - Tế bào vi khuẩn lactic đã chứa sẵn các hợp chất có tính kháng khuẩn như reuterin, reutericyclin, acid 2-Pyrrolidone-5-carboxylic và khi chúng sinh trưởng đã tạo ra thêm những thành phần kháng khuẩn khác bao gồm acid lactic, bacteriocin, CO 2 , H 2 O 2 và diacetyl (Smita et al., 2014). - phần khẳng định tiềm năng sử dụng như một probiotic của các dòng LAB vừa phân lập từ dưa lê non. - Những dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu L22, L61, L64 và L123 có tính kháng khuẩn của bacteriocin mạnh hơn các dòng phân lập từ các ngày lên men khác.. - 3.4 Nhận diện dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Bốn dòng vi khuẩn lactic đã được tuyển chọn để định danh ở mức độ giống dựa vào phương pháp phổ điện di. - Kết quả thu nhận cho thấy, vi khuẩn lactic phân lập từ dưa lê non muối chua băng rõ duy nhất cho mỗi dòng vi khuẩn trên gel điện di với kích thước đoạn gen khoảng 1.500 bp. - Kết quả phổ điện di của 4 dòng vi khuẩn thể hiện ở Hình 2.. - Hình 2: Phổ điện di của gen 16S rRNA của 4 dòng vi khuẩn và Ladder 100 bp plus Bốn dòng vi khuẩn được định danh bằng. - phương pháp giải, phân tích trình tự gen 16S rRNA và so sánh kết quả trên ngân hàng gen NCBI bằng. - Bảng 4: So sánh kết quả giải trình tự trên ngân hàng gen NCBI. - Mẫu Mã gen Các dòng so sánh Số base Độ tương đồng Loài xác định L123 CP012650.1 L.plantarum strain HFC8 497 99% L.plantarum L22 KP742817.1 P. - Kết quả từ Bảng 4.18, bốn dòng có mức độ tương đồng về trình tự gen 16S rRNA với các dòng vi sinh vật: Lactobacillus plantarum. - Các dòng vi khuẩn được đặt tên tương ứng là L. - Trình tự. - gene 16S rRNA của dòng L22, L61, L64 và LE123 được thể hiện ở Bảng 5.. - Như vậy, bốn dòng vi sinh vật phân lập đã được nhận diện bằng kỹ thuật sinh học phân tử đều là thuộc giống vi khuẩn lactic. - Nghiên cứu về hệ vi sinh vật hiện diện trong sản phẩm lên men cho thấy vi khuẩn sinh acid lactic chiếm ưu thế tăng nhanh trong suốt quá trình lên men.. - Bảng 5: Trình tự gene 16S rRNA của 4 dòng vi khuẩn. - Mẫu Trình tự gene 16S rRNA của dòng L22, L61, L64 và LE123. - Từ quy trình chế biến dưa lê non muối chua bằng phương pháp lên men tự nhiên đã phân lập được 19 dòng vi khuẩn thể hiện các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn acid lactic: Gram dương không di động, không sinh bào tử, không phản ứng indole, sinh acid lactic và phân giải CaCO 3 , catalase và oxidase âm tính. - Trong đó, 9 dòng có khả năng. - sinh bacteriocin kháng lại vi khuẩn chỉ thị (Salmonella enteritidis, S. - coli), 4 dòng L22, L61, L64 và LE123 có khả năng kháng lại hoạt động của cả 4 dòng khuẩn chỉ thị ở mức trung bình và cao. - Việc sử dụng kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA cho thấy, dòng L22 được xác định là Pediococcus acidilactici, ba dòng vi khuẩn L61, L64 và L123 có mức độ tương đồng trên 99%. - về trình tự gen 16S rRNA lần lượt với các dòng. - Các dòng vi khuẩn có đặc tính probiotic từ những nguồn này còn có thể sử dụng trong các chế phẩm sinh học nếu được nghiên cứu có hệ thống.. - Nghiên cứu bổ sung giống vi khuẩn lactic trong chế biến mắm chua cá sặc. - Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. - Thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococus lactic cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. - Ảnh hưởng của kích cỡ nguyên liệu và khối lượng mẻ đến quá trình lên men lactic dưa leo