- DOI:10.22144/ctu.jvn.2019.017 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN DÒNG VI KHUẨN Lactobacillus CÓ. - Trong 18 dòng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu môn ngọt (Colocasia esculenta (L.) Schott) trên môi trường MRS, có 7 dòng vi khuẩn có khả năng sống trong điều kiện pH = 2,5 và kháng được 3 loại kháng sinh: ampicilline, tetracyline và ofloxacine. - Ba dòng NKC1, OML1 và OML2 có khả năng kháng vi khuẩn E. - Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào, 7 dòng vi khuẩn trên có khả năng sinh 2 loại enzyme ngoại bào, trong đó, dòng OML2 sinh tổng hợp enzyme amylase cao nhất. - Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ cây môn ngọt (Colocasia esculenta (L.) Schott). - Lactobacillus là nhóm vi khuẩn acid lactic (LAB) được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực probiotic. - LAB là vi khuẩn an toàn và được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm men vi sinh (Haghshenas et al., 2015). - Tiếp đó, Prawan and Bhima (2017) đã phân lập được các dòng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus từ khoai tây, cà chua và cải bắp.. - Do đó, việc nghiên cứu và phân lập những dòng vi khuẩn Lactobacillus từ cây môn ngọt (một loài cây thuộc họ khoai môn) có thể làm đa dạng nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic và tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tốt do cây môn ngọt có khả năng sống được ở nhiều vùng môi trường khác nhau.. - Môi trường MRS lỏng (De Man, Rogosa và Sharpe, sản xuất năm 2016, Thermo Fisher Scientific) cải tiến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus spp.. - Môi trường LB (Luria-Bertani, SBC Scientific) nuôi vi khuẩn E. - 2.2.1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn thuộc Lactobacillus spp. - Phân lập những dòng vi khuẩn từ cây môn ngọt Xử lý mẫu: môn ngọt được rửa sạch bằng nước cất và khử trùng bên ngoài bằng ethanol 70 o . - sau 48 giờ, quan sát và chọn những khuẩn lạc tiêu biểu để tiến hành cấy chuyển vi khuẩn cũng trên môi trường MRS agar. - Quá trình cấy chuyển được lặp lại nhiều lần cho đến khi độ thuần vi khuẩn được xác định.. - Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho các vi khuẩn Lactobacillus spp.. - Đặc điểm nhận dạng khuẩn lạc: những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, độ nổi lài hoặc mô, bìa nguyên hoặc chia thùy. - Kiểm tra các đặc điểm sinh hóa tiêu biểu cho các vi khuẩn Lactobacillus spp.. - Sau khi chọn những dòng vi khuẩn tiêu biểu từ cây môn ngọt, vi khuẩn Lactobacillus spp. - Bảng 1: Đặc điểm sinh hóa tiêu biểu của các vi khuẩn Lactobacillus spp.. - 2.2.2 Đánh giá và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp. - Đánh giá khả năng chống chịu với môi trường pH thấp. - Các dòng vi khuẩn đã phân lập được nuôi tăng sinh trong môi trường MRS lỏng ở 37 o C trong 48 giờ. - thu lấy sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 5.000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút. - sau đó, rửa sinh khối thu được với 1,5 mL nước cất vô trùng và chuyển dịch huyền phù vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường MRS đã chỉnh pH = 2,5, pH = 2,0 và pH = 1,5, ủ ở 37 o C. - sau 48 giờ, tiến hành đếm mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống (Hoben and Somasegaran, 1982). - Đánh giá khả năng kháng các loại kháng sinh Tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa (Sharma et al., 2016) có hiệu chỉnh. - Dịch vi khuẩn Lactobacillus sau khi tăng sinh 48 giờ có mật số tương đương 10 8 tế bào/mL (TB/mL). - sau đó, hút 50 µL dịch vi khuẩn trải đều trên bề mặt môi trường MRS agar. - Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch (Taheri et al., 2010). - Vi khuẩn Lactobacillus được nuôi đến 10 8 TB/mL. - gelatin cho phản ứng khảo sát khả năng sinh enzyme protease. - quan sát khả năng tạo vòng phân giải cơ chất sau 24 giờ. - Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli. - Tăng sinh các dòng vi khuẩn Lactobacillus, sau đó xác định khả năng ức chế E.. - bơm 50 µL dịch nuôi của vi khuẩn Lactobacillus spp./giếng. - 2.2.3 Định danh dòng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus được phân lập có tiềm năng probiotic tốt nhất. - Xác định loài của dòng vi khuẩn đã phân lập có tiềm năng probiotic tốt nhất bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp với đặc điểm hình thái và thí nghiệm sinh hóa. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn acid lactic thuộc loài Lactobacillus spp.. - Trên môi trường MRS đã phân lập được 18 dòng vi khuẩn từ cây môn ngọt tại 3 quận thuộc thành phố Cần Thơ. - Đặc điểm khuẩn lạc của 18 dòng vi khuẩn được quan sát trên môi trường MRS agar (có bổ sung 0,5% CaCO 3 ) sau 48 giờ ủ ở 37 o C cho thấy tất cả. - Khi kiểm tra hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quang học, tế bào của 18 dòng vi khuẩn đã phân lập được sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường MRS agar đều có hình que ngắn (12 dòng, chiếm 66,67%) hoặc que dài (6 dòng, chiếm 33,33. - Ngoài ra, 18 dòng vi khuẩn trên đều không có khả năng di động và không sinh bào tử (Bảng 2).. - Đặc điểm sinh hóa của 18 dòng vi khuẩn được phân lập: tất cả 18 dòng vi khuẩn đều có 4 đặc điểm là: Gram dương. - và có khả năng phân giải CaCO 3. - Bảng 2: Đặc điểm hình thái của 18 dòng vi khuẩn phân lập được từ cây môn ngọt tại thành phố Cần Thơ. - Ghi chú: Ký hiệu các dòng vi khuẩn được phân lập đặt tên dựa theo quận thu mẫu: NK là mẫu thu tại Ninh Kiều, CR là mẫu thu tại Cái Răng, OM là mẫu thu tại Ô Môn. - Các chữ cái C và L là dòng vi khuẩn được phân lập trên mẫu củ và lá. - Kết hợp giữa đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa, có thể kết luận 18 dòng vi khuẩn phân lập từ cây môn ngọt Colocasia esculenta (L.) Schott ở Cần Thơ thuộc Lactobacillus spp. - Kết quả phân lập và nhận diện vi khuẩn Lactobacillus spp. - 3.2 Kết quả đánh giá tiềm năng probiotic của các dòng vi khuẩn. - 3.2.1 Khả năng chịu pH thấp. - Dòng NKL1 có khả năng sống sót thấp. - (2014) khiphân lập được 9 dòng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus từ sữa mẹ, phân trẻ sơ sinh và thực phẩm lên men, tất cả đều có khả năng chịu pH = 3 trong 3 giờ. - Bên cạnh đó, 6/7 dòng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học cũng có khả năng chống chịu với môi. - Trong nghiên cứu này, 7/18 dòng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập từ cây môn ngọt có khả năng sống sót trong môi trường pH = 2,5 trong 24 giờ, đồng nghĩa với việc chúng có khả năng chịu được pH = 3 trong 3 giờ, thỏa một trong những điều kiện quan trọng trong việc lựa chọn các dòng vi sinh vật probiotic ứng dụng cho người (Matijasic and Rogelj, 2000. - Bảng 3: Khả năng chịu pH thấp của dòng vi khuẩn Lactobacillus. - 3.2.2 Khả năng kháng kháng sinh. - Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 7 dòng Lactobacillus đã khảo sát đều không có vòng vô khuẩn đối với kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn (ampiciline), kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn (tetracycline) và kháng sinh nhóm ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn (ofloxacine).. - Dựa vào 3 mức độ đánh giá khả năng kháng kháng sinh của CLSI (2012) và nghiên cứu của Sharma et al. - (2016) cho thấy, cả 7 dòng Lactocbacillus được khảo sát đều có khả năng kháng với 3 loại kháng sinh: ampicilline, tetracyline, và ofloxacine. - (2014) khi khảo sát khả năng kháng. - Tương tự, nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và Phạm Thị Lan Anh (2011) trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng kháng sinh của các chủng Lactobacillus cho kết quả: 12/12 dòng vi khuẩn đều có khả năng kháng với kháng sinh ức chế tổng hợp protein, 10/12 dòng kháng với kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào và 5/12 dòng kháng với kháng sinh ức chế tổng hợp acid nucleic.. - Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng vi khuẩn phân lập từ cây môn ngọt có khả năng kháng kháng sinh, nếu sử dụng chúng như một probiotic cho bệnh nhân điều trị bệnh liên quan đến đường tiêu hóa bằng kháng sinh sẽ đạt hiệu quả tốt hơn do probiotic có khả năng thiết lập hệ vi sinh vật có ích trong đường ruột một cách nhanh chóng (EI-Naggar, 2004). - Vì thế, có thể sử dụng các dòng vi khuẩn phân lập từ cây môn ngọt cho hai mục đích phòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa.. - 3.2.3 Khả năng sinh enzyme ngoại bào Kết quả từ Hình 1 cho thấy, cả 7 dòng Lactobacillus phân lập từ cây môn ngọt đều thể hiện khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease.. - Tương tự, nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn phân lập từ mắm chua cá sặc của Đỗ Thị Tuyết Nhung và ctv. - Bên cạnh đó, nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Hằng và Nguyễn Minh Thư (2013) về khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập từ sản phẩm lên men, thu được 7 dòng Lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase với đường kính vòng phân giải tinh bột dao động từ 8 - 20 mm.. - Hình 1: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của những dòng Lactobacillus. - 3.2.4 Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli. - Bảng 4: Khả năng ức chế vi khuẩn E. - Khi cho 7 dòng vi khuẩn thuộc Lactobacillus spp. - được phân lập từ cây môn ngọt ở thành phố Cần Thơ tương tác với vi khuẩn E. - đã phân lập tạo vòng vô khuẩn với vi khuẩn E. - Dòng OML1, OML2 và CRC1 là 3 dòng vi khuẩn có khả năng kháng E. - Ngược lại, dòng NKL1 có khả năng ức chế E. - coli thấp nhất (2,33 mm) trong 7 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế E. - Theo quy ước của Galindo (2004) về khả năng ức chế vi khuẩn, thì cả 7 dòng vi khuẩn trong khảo sát đều có khả năng kháng E.coli (ĐKVVK <. - có khả năng tạo bacteriocin ức chế vi khuẩn E. - được phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) có khả năng tạo bacteriocin ức chế 2 vi khuẩn là Aeromonas hydrophila và Edwardsiella ictaluri.. - Dòng vi khuẩn OML2 là dòng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus spp. - và cũng là dòng vi khuẩn tối ưu nhất trong 18 dòng vi khuẩn được phân lập từ cây môn ngọt về khả năng chịu pH thấp, khả năng kháng kháng sinh, cũng như khả năng sinh enzyme ngoại bào và khả năng kháng khuẩn. - Sau khi sử dụng chương trình Nucleotide Blast để so sánh mức độ tương đồng của trình tự được giải với trình tự của các dòng vi khuẩn trong ngân hàng gen trên NCBI, kết quả cho thấy trình tự đoạn gen của dòng OML2 tương đồng với trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 với độ tương đồng là 99%. - Kết hợp giữa kết quả nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử (giải trình tự bằng đoạn mồi chung 16S rRNA) cùng kết quả quan sát hình thái và thí nghiệm sinh hóa cho thấy dòng OML2 có trình tự 16S rRNA và các đặc tính sinh hóa tương đồng với loài Lactobacillus plantarum.. - Hình 2: Kết quả so sánh mức độ tương đồng với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gen NCBI Dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum là một. - trong những dòng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau như: sữa, rượu vang, thịt bò, sản phẩm lên men, đường tiêu hóa của người và động vật (Bringel et al., 2005). - (2017) đã cho thấy Lactobacillus plantarum có khả năng ngăn chặn sự phát triển của 2 dòng vi khuẩn gây bệnh đường ruột là Acinetobacter baumannii và Pseudomonas aeruginosa. - Mười tám dòng vi khuẩn thuộc Lactobacillus spp. - Các thử nghiệm kiểm tra tiềm năng probiotic cho kết quả: 7/18 dòng vi khuẩn đều có khả năng kháng với 3 loại kháng sinh và chịu được môi trường pH = 2,5. - Trong đó, 2 dòng OML2 và CRC1 có khả năng chịu pH thấp tốt nhất với mật số lần lượt là 6,64 và 6,63 log (cfu/mL). - Ngoài ra, 7 dòng vi khuẩn trên cũng có khả năng kháng khuẩn E. - Định danh và xác định một số đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn lactic trong sản phẩm mắm chua cá sặc. - Nghiên cứu bổ sung giống vi khuẩn lactic trong chế biến mắm chua cá sặc. - Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus sp. - có khả năng kháng khuẩn từ tôm sú (Penaeus monodon) ở tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau. - Khảo sát đặc tính probiotic các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tại các tỉnh Đồng Bằng sông Cửu Long. - Khảo sát khả năng chống chịu điều kiện pH thấp và kháng thuốc kháng sinh của hệ vi khuẩn acid lactic phân lập từ sữa dê và chế phẩm sinh học. - Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp amylase và bacteriocin. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp. - có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ trên cá tra