- DOI:10.22144/ctu.jvn.2019.044 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG XẠ KHUẨN TRIỂN VỌNG ĐỐI KHÁNG. - Chitinase, Pratylenchus sp., protease, xạ khuẩn đối kháng Keywords:. - Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn triển vọng có khả năng đối kháng với tuyến trùng Pratylenchus sp. - Sáu mươi bốn chủng xạ khuẩn đã được phân lập từ đất trồng rau ở Trà Vinh và Cần Thơ. - Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng phân giải chitin và protein cao nhằm mục đích phòng trị bằng cách phá vỡ vách tế bào của tuyến trùng. - Kết quả cho thấy, sáu chủng xạ khuẩn: 4A1, BM A6 và SM8 đều thể hiện hoạt tính tiết enzyme chitinase và protease cao. - với số lượng tuyến trùng sống thấp hơn khác biệt ý nghĩa so với đối chứng, trong đó nghiệm thức hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn (4A1+BM15+8.11.1) cho hiệu quả cao nhất trong việc giết tuyến trùng ở 48 và 72 giờ thử nghiệm.. - Phân lập và tuyển chọn những chủng xạ khuẩn triển vọng đối kháng với tuyến trùng Pratylenchus sp. - (2000) sử dụng vi khuẩn vùng rễ, xạ khuẩn và vi khuẩn Pasteuria penetrans trong phòng trừ tuyến trùng bưới rễ M. - “Phân lập và tuyển chọn những dòng xạ khuẩn triển vọng đối kháng với tuyến trùng Pratylenchus sp. - trong điều kiện invitro.” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng xạ khuẩn triển vọng có khả năng đối kháng với tuyến trùng Pratylenchus sp.. - 2.2.1 Phân lập xạ khuẩn tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. - Các mẫu đất sau khi thu thập được cho vào trong túi nylon riêng lẻ và mang về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập xạ khuẩn. - Quy trình phân lập xạ khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Hsu và Lockwood (1975).. - Sau 4 -5 ngày, xạ khuẩn sẽ phát triển trong đĩa, chọn những xạ khuẩn phân giải chitin để thực hiện tách ròng trên môi trường Mannitol Soya flour (MS) (Mannitol 20 g, bột đậu nành 20 g, agar 20 g, nước cất 1000 ml, pH 7,0) (Hobbs et al., 1989) bằng phương pháp vạch và chọn khuẩn lạc riêng lẻ để cấy trữ trong ống nghiệm chứa môi trường MS trong điều kiện 4 0 C.. - 2.2.2 Đánh giá khả năng phân giải Chitin của xạ khuẩn được phân lập trong điều kiện in vitro. - Mục đích: Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tiết chitinase cao để phục vụ cho thí nghiệm khảo sát khả năng tiêu diệt tuyến trùng.. - Thí nghiệm A: Thực hiện đánh giá nhanh khả năng tiết chitinase của 64 chủng xạ khuẩn được phân lập với 2 lần lặp lại nhằm tuyển chọn các chủng xạ khuẩn tiết chitinase.. - Thí nghiệm B: So sánh khả năng tiết chitinase của các chủng xạ khuẩn được chọn từ thí nghiệm A.. - Nhúng khoanh giấy thấm (đường kính 5 mm) đã được vô trùng vào huyền phù xạ khuẩn mật số 10 8 cfu/ml. - Đối với thí nghiệm B, sử dụng 14 chủng xạ khuẩn được chọn ra từ thí nghiệm A và 5 chủng xạ khuẩn tiết enzyme chitinase cao từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật để tiến hành thí nghiệm.. - Ghi nhận khả năng tiết enzyme chitinase của xạ khuẩn thông qua đo bán kính vùng phân giải chitin ở thời điểm 5, 7 và 9 ngày sau khi cấy (NSKC).. - 2.2.3 Đánh giá khả năng tiết enzyme protease của xạ khuẩn trong điều kiên in vitro. - Mục đích: Nhằm tìm ra các chủng xạ khuẩn có khả năng tiết ra enzyme protease cao.. - Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn và cách tiến hành thí nghiệm tương tự như thí nghiệm B (phần 2.2.2) và môi trường chitin agar được thay bằng môi trường Skimmilk Agar (sữa tách béo 35g, agar 18g, nước cất 1000ml) (Wei et al., 2010).. - Ghi nhận khả năng tiết protease của xạ khuẩn thông qua việc đo bán kính vùng phân giải protein ở thời điểm 3, 4 và 5 NSKC.. - của dịch trích nuôi cấy từ các xạ khuẩn triển vọng trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Mục đích: Chọn những chủng xạ khuẩn có khả năng tiêu diệt tuyến trùng Pratylenchus sp. - Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức gồm: ĐC (đối chứng, sử dụng ISP2 lỏng), thuốc Abamectin (đối chứng dương, nồng độ 20 µl/20 ml), xạ khuẩn 4A1, xạ khuẩn 8.11.1, xạ khuẩn BM15 và hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn (4A1+BM15+8.11.1) với 4 lần lặp lại.. - Chuẩn bị dịch trích của xạ khuẩn: Các dòng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MS trong 7 ngày. - Tiếp theo, rút 1ml huyền phù xạ khuẩn cho vào mỗi bình có chứa 100 ml môi trường ISP2 lỏng (Yeast extract 4g, Glucose 4g, Malt extract 10g, agar 20 g, nước cất 1000 ml) (Holt et al., 1994), có bổ sung thêm 10g chitin thô đã nghiền thành colloidal chitin trong 1000ml môi trường ISP2 lỏng và được lắc ở 100 vòng/phút trong 7 ngày. - Sau đó, thu dịch trích xạ khuẩn bằng cách: ly tâm huyền phù xạ khuẩn ở 6000 vòng/phút (trong 10 phút), lấy phần dịch bên trên lọc qua dụng cụ lọc vi khuẩn có đường kính lỗ lọc 0,45 µm, dung dịch qua lọc thu được là dịch trích xạ khuẩn.. - Sau đó, hút 10ml dịch trích xạ khuẩn phun thấm đều xuống đất. - 3.1 Phân lập xạ khuẩn và tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng phân giải chitin. - Phân lập xạ khuẩn. - Hình 1: Đặc điểm khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn được phân lập. - Kết quả phân lập được 64 chủng xạ khuẩn được trình bày ở Bảng 1. - Khi quan sát các chủng xạ khuẩn được phân lập trên môi trường MS cho thấy xạ khuẩn rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc khuẩn lạc. - Màu sắc các chủng xạ khuẩn được. - Bề mặt khuẩn lạc khô ráo, không bóng như vi khuẩn, hình dạng chủ yếu hình tròn, một số chủng tạo thành vòng tròn đồng tâm, hệ sợi cơ chất phát triển cấm sâu vào môi trường và đây cũng là đặc điểm giúp phân biệt giữa xạ khuẩn với vi khuẩn và nấm (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002). - Ngoài ra, khả năng phát triển của các chủng xạ khuẩn trên môi trường MS tương đối chậm từ 3-5 ngày tùy theo các chủng xạ khuẩn khác nhau. - Kết quả này phù hợp với miêu tả của Dương Vân Anh (2017) đã khảo sát về hình thái của các chủng xạ khuẩn trên môi trường MS và ISP2 cũng cho thấy khuẩn lạc xạ khuẩn có nhiều màu sắc như xám, nâu, dạng khô ráp. - Tương tự kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Hà (2008), khi phân lập xạ khuẩn từ các mẫu đất trồng chè ở Thái Nguyên cho thấy các chủng xạ khuẩn có màu sắc khuẩn lạc rất đa dạng như nâu, trắng, xanh trên môi trường ISP2.. - Qua đánh giá sơ tuyển khả năng phân giải chitin được thực hiện trên 64 chủng xạ khuẩn trên môi trường chitin agar cho thấy có 32 chủng xạ khuẩn phân giải chitin chiếm tỷ lệ 50%. - Trong đó, các chủng xạ khuẩn có bán kính phân giải chitin (BKPGC) trung bình của 2 lần lặp lại ở thời điểm 9 ngày sau khi cấy (NSKC) từ 1 mm đến 4 mm chiếm khoảng 42,20%. - BKPGC<1 mm chiếm khoảng 7,8% và có khoảng 50% chủng xạ khuẩn không phân giải chitin. - Dựa trên cơ sở đó, tuyển chọn được 19 chủng xạ khuẩn có bán kính phân giải cao nhất để thực hiện thí nghiệm so sánh khả năng phân giải chitin.. - Bảng 1: Các chủng xạ khuẩn được phân lập trên các ruộng rau tại Trà Vinh và Cần Thơ STT Mã số Địa điểm phân lập. - khuẩn được phân lập trong điều kiện in vitro Qua kết quả Bảng 2, khi so sánh 19 chủng được chọn với 4 lần lặp lại cho thấy rằng hầu hết các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải chitin bắt đầu từ thời điểm 5 NSKC.. - Ở thời điểm 5 NSKC, có 12/19 chủng xạ khuẩn phân giải chitin với bán kính vòng phân giải chitin dao động từ 0,2 – 2,5 mm. - Chủng 4A1 có bán kính phân giải cao nhất là 2,5 mm khác biệt có ý nghĩa với các chủng xạ khuẩn còn lại. - Thời điểm 7 NSKC, số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải chitin tăng lên được 13/19 chủng.. - Chủng xạ khuẩn 4A1 vẫn ở vị trí cao nhất với bán kính vòng phân giải là 3,1 mm cao hơn và khác biệt ý nghĩa hoàn toàn so với các chủng còn lại. - Kế tiếp là 2 chủng xạ khuẩn BM15, 8.11.1 với bán kính phân giải lần lượt là 2,2 và 2,0 mm khác biệt ý nghĩa với các chủng khác. - Mặc dù, chủng xạ khuẩn 8.11.1 không khác biệt ý nghĩa đối với chủng 5A6, nhưng lại khác biệt ý nghĩa với các chủng xạ khuẩn còn lại (Hình 2).. - Bảng 2: Khả năng phân giải chitin (mm) của 19 chủng xạ khuẩn qua các thời điểm STT Chủng xạ. - Đến thời điểm 9 NSKC, toàn bộ 19 chủng xạ khuẩn đều thể hiện khả năng phân giải chitin, trong đó 3 chủng xạ khuẩn 4A1, BM15, 8.11.1 vẫn là những chủng xạ khuẩn chiếm vị trí phân giải chitin cao với bán kính phân giải lần lượt là 3,8 mm. - 2,6 mm và chủng xạ khuẩn 4A1 vẫn là chủng luôn khác biệt ý nghĩa với các chủng còn lại, kế tiếp là 3 chủng 5A6, SM8 và 9.3.1 với bán kính phân giải lần lượt là 2,3 mm, 1,9 mm và 1,5 mm cao hơn và khác biệt ý nghĩa với các chủng xạ khuẩn BM3, 5A9, 5A2, 4A2, TL1, SM9, 4A5, 2.1.1, BM6 và NT2.. - Tóm lại, qua 3 thời điểm khảo sát 5 NSKC, 7 NSKC và 9 NSK, nhìn chung các chủng xạ khuẩn đều thể hiện khả năng phân giải chitin. - Trong đó, có 6 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng phân giải tốt nhất là 4A1, BM A6, SM8 và 9.3.1. - Kết quả khảo sát khả năng phân hủy chitin phù hợp với nghiên cứu của Đinh Ngọc Trúc và Trần Vũ Phến (2014) xạ khuẩn có khả năng tiết enzyme chitinase và phân giải chitin cũng bắt đầu thể hiện vào thời điểm 5 NCKC.. - Hình 2: Bán kính phân giải chitin của một số chủng xạ khuẩn ở thời điểm 7 NSKC. - 3.2 Khả năng phân giải protein của xạ khuẩn trong điều kiện in vitro. - Bảng 3: Khả năng phân giải protein của 6 chủng xạ khuẩn qua các thời điểm STT Chủng xạ. - Ở thời điểm 3NSKC, các chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng phân giải protein ngoại trừ 2 chủng SM8 và 5A6, nhưng đến thời điểm 4NSKC toàn bộ các chủng đều phân giải protein. - Điều này cho thấy khả năng phân giải protein của xạ khuẩn có khuynh hướng nhanh hơn phân giải chitin, kết quả được ghi nhận tương tự với nghiên cứu của Huỳnh Trường Giang và Lê Minh Tường (2017). - Nhìn chung, qua 3 thời điểm khảo sát cho thấy chỉ có chủng xạ khuẩn 4A1 có khả năng phân giải cao nhất, kế đến là các chủng BM A6.. - Vào thời điểm 3NSKC, có 4 chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng phân giải protein là 4A1, BM15,. - 8.11.1 và 9.3.1, trong đó 4A1 vẫn là chủng xạ khuẩn thể hiện khả năng phân giải protein cao nhất với BKPGP là 3 mm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa hoàn toàn so với các chủng còn lại. - Kế đến là các chủng xạ khuẩn gồm BM15 với BKPGP lần lượt là 3,5 mm, 3,1 mm, 2,6 mm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa với 2 chủng còn lại (Hình 3).. - Hình 3: Bán kính phân giải protein của 6 chủng xạ khuẩn ở thời điểm 4 NSKC. - Tại thời điểm 5 NSKC, chủng 4A1 với BKPGP tăng lên 6, 8 mm vẫn khác biệt ý nghĩa với các chủng xạ khuẩn khác. - Như vậy, qua 2 thí nghiệm khảo sát khả năng phân giải chitin và protein cho thấy rằng 3 chủng xạ khuẩn là chủng 4A1, 8.11.1, BM15, có khả năng phân giải chitin và protein cao nên được chọn để đánh giá hiệu quả phòng tuyến trùng Pratylenchus sp. - Kết quả trong thí nghiệm trên cho thấy 3 chủng xạ khuẩn này có liên đến khả năng phân giải vách tế bào tuyến trùng, bởi vì theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000) vách tế bào của cơ thể tuyến trùng được bao bọc bằng lớp vỏ chitin là nơi gắn các bắp thịt đảm bảo cho tuyến trùng có độ căng cần thiết và nhiệm vụ quan trọng hơn là giúp bảo vệ cơ thể, tránh tác động bên ngoài và giúp tuyến trùng chuyển động.. - Vì vậy, khả năng phân giải chitin và protein thông qua việc tiết enzyme chitinase và enzyme protease của xạ khuẩn có thể làm phân hủy lớp vỏ trứng tuyến trùng làm chúng không thể nở thành ấu trùng tuổi 2, cũng như hạn chế khả năng lưu tồn của trứng. - 3.3 Ảnh hưởng của dịch trích xạ khuẩn lên tuyến trùng Pratylenchus sp. - còn sống từ các mẫu đất vào 3 thời điểm 24, 48 và 72 giờ ở các nghiệm thức cho thấy các chủng xạ khuẩn đều có khả năng gây chết tuyến trùng (Bảng 4 và 5).. - còn sống qua các thời điểm sau khi xử lý dịch trích xạ khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Bảng 5: Hiệu lực của dịch trích xạ khuẩn đối với tuyến trùng Pratylenchus sp. - Ở thời điểm 24 GSKXL, số tuyến trùng sống ở các nghiệm thức xử lý dịch trích của các chủng xạ khuẩn 4A1, BM hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1 và hoạt chất abamectin đều thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng, trong đó nghiệm thức abamectin thể hiện hiệu quả cao hơn các nghiệm thức xử lý xạ khuẩn (Bảng 4 và 5).. - Đến thời điểm 48 GSKXL, thời điểm này bắt đầu có sự khác biệt giữa các nghiệm thức xử lý xạ khuẩn.. - Trong đó, nghiệm thức hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1 thể hiện khả năng giết chết tuyến trùng mạnh hơn với số trung bình con tuyến trùng còn sống là 81,25 thấp hơn và hiệu lực phòng. - trị đạt 76,35% khác biệt so với ba nghiệm thức xử lý xạ khuẩn đơn còn lại. - Tương tự, tại thời điểm 72 giờ, tất cả các nghiệm thức xử lý dịch trích xạ khuẩn đều thể hiện hiệu lực giết chết tuyến trùng, trong đó hỗn hợp dịch trích của 3 chủng xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1 thể hiện hiệu quả cao hơn với số tuyến trùng còn sống là 65,75 và hiệu lực phòng trị đạt 74,58% khác biệt ý nghĩa so với dịch trích chủng 8.11.1. - Nghiệm thức hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1. - Nhìn chung, cả 3 thời điểm xử lý, dịch trích các chủng xạ khuẩn đều thể hiện khả năng gây chết tuyến trùng. - Trong đó, hỗn hợp dịch trích xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1 cho hiệu quả gây chết tuyến trùng cao nhất, dịch trích chủng xạ khuẩn 8.11.1 có hiệu quả diệt tuyến trùng thấp hơn so với chủng 4A1, BM15. - Sự khác biệt về hiệu lực gây chết giữa nghiệm thức xử lý dịch trích từ các chủng xạ khuẩn khác nhau thể hiện rõ ở giai đoạn sau có thể liên quan đến tính ổn định trong tiêu diệt tuyến trùng của từng loại trích từ xạ khuẩn là khác nhau. - Tóm lại, tuy xạ khuẩn tác dụng chậm nhưng cho hiệu quả gây chết kéo dài. - Ba chủng xạ khuẩn 4A1, BM15, 8.11.1 đều có khả năng tiết enzyme chitinase cao, khi được nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP2 có bổ sung thêm colloidal chitin sẽ tạo điều kiện xạ khuẩn tiết ra nhiều enzyme chitinase trong dịch trích nuôi cấy, từ đó phá hủy lớp chitin của tuyến trùng Pratylenchus sp.. - Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Zhang (2016), khi sử dụng dịch trích của chủng xạ khuẩn S07 để tiêu diệt tuyến trùng. - Kết quả phân lập được 64 chủng xạ khuẩn, trong đó có 6 chủng xạ khuẩn 4A1, BM A6, SM8 có khả năng phân giải chitin và protein cao. - Trong đó, 3 chủng xạ khuẩn 4A1, BM15, 8.11.1 thể hiện khả năng phân giải chitin và protein cao nhất vượt trội hơn các chủng còn lại.. - Dịch trích 3 chủng xạ khuẩn đơn 4A1, BM15, 8.11.1 và hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1 l đều thể hiện khả năng giết chết tuyến trùng. - Trong đó, dịch trích của hỗn hợp 3 chủng xạ khuẩn 4A1+BM15+8.11.1 thể hiện hiệu quả cao hơn so với các chủng xạ khuẩn đơn, đạt hiệu lực phòng trị tới 74,58% vào 72 giờ sau khi xử lý.. - Tiếp tục thực hiện định danh các chủng xạ khuẩn triển vọng và đánh giá hiệu quả của các xạ khuẩn. - Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. - Đánh giá hiệu quả phòng trị của xạ khuẩn và thuốc hóa học đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp. - Khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn đối với nấm Pyricularia oryzae Cavara và cơ chế có liên quan trong điều kiện in vitro. - Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh hại khoai lang