- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CHỊU NHIỆT. - P014, Pseudomonas putida Rs- 198, keratin, vi khuẩn chịu nhiệt. - Nhiệt độ ở các hố chôn nguồn chất thải lông có thể tăng cao và làm ức chế hoạt động phân hủy của các dòng vi khuẩn thông thường. - Vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy mạnh các cơ chất chứa keratin từ nguồn chất thải của lò giết mổ gia súc. - Với 18 dòng vi khuẩn hiếu khí chịu nhiệt đã được phân lập từ năm mẫu đất và hai mẫu nước trên môi trường có bổ sung bột lông gia cầm. - Và 18 dòng vi khuẩn đều có khả năng phát triển và phân hủy keratin ở 45 o C. - Các mẫu được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ để phân lập và khảo sát khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin của vi khuẩn.. - Kết quả phân lập được 18 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông vũ với đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục, với đa số tế bào hình que chỉ 1 tế bào hình cầu (15 dòng gram âm và 3 dòng gram dương). - kết quả phân hủy bột lông dê là và 42,18%. - Kết quả xác định trình tự của đoạn gen 16S rRNA dòng vi khuẩn V1 tương đồng với Bacillus megaterium ở mức 99% và dòng V2 tương đồng với Bacillus sp.. - Hướng xử lý mới cho nguồn chất thải này đang được nghiên cứu và mang lại hiệu quả thiết thực đó là sử dụng các dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh keratinase. - Bên cạnh đó, trong việc xử lý các nguồn chất thải chứa keratin, nhiệt độ trong quá trình phân hủy có thể tăng cao, gây ức chế hoạt động của hầu hết các dòng vi khuẩn hoạt động phân hủy nguồn chất thải này. - 2.3 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải keratin trên môi trường lông gia cầm. - Khảo sát khả năng chịu nhiệt của các dòng vi khuẩn bằng cách cấy các dòng vi khuẩn sang môi trường bột lông và ủ ở lần lượt các mức 50ºC, 55ºC, 60ºC và theo dõi sự phát triển của chúng trong vòng 24h-48h. - Các mẫu vi khuẩn ròng được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường bột lông vũ và trữ ở 4 o C.. - 2.4 Đánh giá khả năng phân hủy lông vũ của các dòng vi khuẩn phân lập được. - Thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy lông vũ gồm 19 nghiệm thức với yếu tố thí nghiệm là loại vi khuẩn (18 dòng và nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn). - Từng dòng vi khuẩn đã phân lập được nuôi trong môi trường tăng sinh khối (môi trường có bổ sung bột lông vũ như trên nhưng không chứa agar) đến khi đạt mật số khoảng 10 11 tế bào/ml. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi dòng vi khuẩn. - lông vũ bị phân hủy bởi các dòng vi khuẩn được tính theo phương pháp được mô tả bởi Nguyễn Thu Hiền và ctv, 2010.. - Khảo sát khả năng phân hủy sợi lông gà của các dòng vi khuẩn. - Quan sát và ghi nhận thời gian làm gãy rụng lông đối với mỗi dòng vi khuẩn trong vòng 10 ngày.. - 2.5 Đánh giá khả năng phân hủy lông dê của các dòng vi khuẩn được chọn. - 2.6 Nhận diện các dòng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Qui trình được thực hiện như sau: ly trích DNA của vi khuẩn;. - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn. - Tất cả các dòng vi khuẩn trên đều có thể phát triển và phân hủy keratin ở môi trường nhiệt độ cao từ 45 o C đến 55 o C. - Bảng 1: Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập được. - 3.2 Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 24h nuôi ủ ở các mức nhiệt độ thì các dòng vi khuẩn đều cho thấy khả năng sinh protease (tạo vòng halo trên. - 3.2.1 Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 45 o C. - Hình 1: Đường kính vòng phân hủy của các dòng vi khuẩn trên môi trường sữa sau 24h ủ ở 45 o C Các giá trị mang các mẫu tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. - Hai dòng vi khuẩn V2 và V9 tạo được vòng phân hủy tốt nhất trong nhóm với đường kính vòng phân hủy lần lượt là 10,3 mm của dòng V2 và 10,2 mm với dòng V9, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các dòng còn lại cùng nhóm.. - 3.2.2 Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 50 o C. - Sự tạo vòng phân hủy của nhóm vi khuẩn khảo sát ở 50°C đồng đều hơn nhóm 45°C. - Dòng Vi khuẩn. - Đường kính phân hủy (mm). - Hình 2: Đường kính phân hủy của các dòng vi khuẩn trên môi trường sữa sau 24 giờ ủ ở 50 o C Các giá trị mang các mẫu tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. - 3.2.3 Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 55 o C. - Khả năng tạo vòng phân hủy của nhóm vi khuẩn khảo sát ở 55°C là không đáng kể với 4,7 mm của dòng V17 và 7,2 mm của dòng V18 sau 24 giờ ủ.. - 3.3 Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn. - Sau bảy ngày chủng và lắc ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau thì kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân hủy keratin qua việc phân hủy bột lông gia cầm, khác biệt ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng (không chủng vi khuẩn). - Riêng nhóm vi khuẩn khảo sát ở 55°C thì kết. - Kết quả này thấp hơn kết quả của các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất và lông vũ trong nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng et al. - Vì vậy, để có được kết quả phân hủy tốt nhất thì cần xác định các điều kiện tối ưu cho các dòng vi khuẩn phân lập được.. - 3.3.1 Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 45 o C. - Kết quả từ Hình 3 cho thấy khả năng phân hủy lông gia cầm của nhóm vi khuẩn khảo sát ở 45°C có sự khác biệt khá lớn. - Hình 3: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 45 o C Ghi chú: ĐC: đối chứng (mẫu bột lông không chủng vi khuẩn). - Dòng vi khuẩn. - Phần trăm phân hủy. - 3.3.2 Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 50 o C. - Từ Hình 4 cho thấy khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 50°C khá. - đồng đều, không có nhiều chênh lệch như các dòng vi khuẩn ở 45°C. - Hình 4: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn ở 50 o C Ghi chú: ĐC: đối chứng (mẫu bột lông không chủng vi khuẩn). - 3.3.3 Khả năng phân hủy lông gia cầm của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 55 o C. - Các dòng vi khuẩn khảo sát ở 55 o C cũng cho thấy khả năng phân hủy lông gia cầm sau một tuần chủng nhưng kết quả phân hủy không được cao với 27.75% của dòng V17 và 26.75% của dòng V18.. - 3.4 Khả năng phân hủy sợi lông gà của các dòng vi khuẩn khảo sát. - Sau 10 ngày nuôi lắc ở các mức nhiệt độ khác nhau thì kết quả khảo sát sự phân hủy sợi lông gà nguyên cho thấy tất cả 18 dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng làm gãy rụng sợi lông con của cọng lông gà. - Trong đó, nhóm vi khuẩn khảo. - Hình 5: Khả năng phân hủy sợi lông gà của các dòng vi khuẩn sau 10 ngày Ghi chú: ĐC là nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (Hình chụp ngày 8/9/2013. - Hình 6: Khả năng phân hủy sợi lông gà của dòng vi khuẩn V9 sau 10 tuần Ghi chú: ĐC là nghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn (Hình chụp ngày . - 3.5 Khả năng phân hủy lông dê của các dòng vi khuẩn. - Nhóm vi khuẩn khảo sát ở 45°C cho khả năng phân hủy bột lông dê tốt nhất với dòng V9 phân hủy 42,18% lượng bột lông sau một tuần chủng;. - Khảo sát ở nhóm vi khuẩn ở 50°C cho kết quả gần tương đương với nhóm vi khuẩn ở 45°C với dòng V1 phân hủy được 40,47% lượng bột lông sau một tuần chủng, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. - các dòng còn lại cho khả năng phân hủy lông đạt hơn 30%.. - Nhóm vi khuẩn khảo sát ở 55°C thì cho kết quả thấp hơn, với V17 đạt 30,35% và V18 đạt 30,46%. - 3.5.1 Khả năng phân hủy lông dê của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 45 o C. - Khả năng phân hủy bột lông dê của các dòng vi khuẩn ở 45°C là khá cao, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. - Trong đó, các dòng V9 cho kết quả phân hủy bột lông dê tốt nhất với 42,18% lượng bột lông bị phân hủy sau một tuần chủng vi khuẩn. - Hình 7: Khả năng phân hủy bột lông dê của các dòng vi khuẩn ở 45 o C Ghi chú: ĐC: đối chứng (mẫu bột lông không chủng vi khuẩn). - 3.5.2 Khả năng phân hủy bột lông dê của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 50 o C. - Kết quả từ Hình 8 cho thấy nhóm vi khuẩn khảo sát ở 50°C cũng cho kết quả phân hủy bột. - Trong đó, dòng V1 cho kết quả phân hủy tốt nhất với 40,48% lượng bột lông bị phân hủy sau một tuần chủng vi khuẩn.. - Hình 8: Khả năng phân hủy bột lông dê của các dòng vi khuẩn ở 50 o C Ghi chú: ĐC: đối chứng (mẫu bột lông không chủng vi khuẩn). - 3.5.3 Khả năng phân hủy bột lông dê của các dòng vi khuẩn khảo sát ở 55 o C. - Hai dòng vi khuẩn ở 55°C cũng cho thấy khả năng phân hủy bột lông dê khá hữu hiệu, kết quả phân hủy bột lông dê lần lượt của dòng V17 và V18 là 30,35% và 30,47% sau một tuần nuôi lắc.. - 3.6 Kết quả nhận diện 3 dòng vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Ba dòng vi khuẩn V1, V2 và V9 được chọn để nhận diện do khả năng chịu nhiệt cũng như khả năng phân hủy lông gia súc, lông gia cầm khá cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại.. - Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 dòng vi khuẩn cho thấy đã khuếch đại thành công đoạn gen 16S rRNA của chúng với kích thước khoảng 1500bp (Hình 9 và Hình 10).. - Hình 9: Kết quả điện di sản phẩm PCR của 2 dòng vi khuẩn V1 và V2. - Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR của dòng vi khuẩn V9. - Kết quả giải trình tự của 3 dòng vi khuẩn Dòng vi khuẩn V1 có kết quả giải trình tự 16S rDNA như sau:. - Phần trăm phân hủy(%). - Dòng vi khuẩn V2 có kết quả giải trình tự 16S rDNA như sau:. - Dòng vi khuẩn V9 có kết quả giải trình tự 16S rDNA như sau:. - Như vậy, hai dòng vi khuẩn V1 và V2 được tuyển chọn từ nghiên cứu này thuộc chi Bacillus.. - (2007) là phần lớn các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy keratin cao phân lập được đều thuộc chi Bacillus. - Khả năng ứng dụng các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus để xử lí rác thải chứa keratin được kỳ vọng rất cao.. - Bốn dòng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường bột lông vũ được kiểm tra khả năng phân giải protein trên môi trường sữa. - Hoạt tính phân giải protein của dịch trích enzyme thô từ các dòng vi khuẩn này được kiểm tra với hai cơ chất azokeratin và azocasein. - Kết quả cho thấy enzyme keratinase hoạt động trên cả hai cơ chất và có khả năng phân giải keratin tương đương với các enzyme phân giải protein có nguồn gốc từ vi khuẩn trên thị trường.. - 18 dòng vi khuẩn hiếu khí đã được phân lập. - Đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, độ nổi lài và bìa nguyên. - Tất cả các dòng vi khuẩn (trừ dòng V3 có hình cầu) đều có hình que.. - Tất cả 18 dòng vi khuẩn đều phát triển ở mức nhiệt độ từ 45°C đến 55°C. - Cả 18 dòng vi khuẩn đều biểu hiện hoạt tính protease trên môi trường sữa với đường kính phân hủy biến thiên từ 4,7 mm đến 10,3 mm sau 24 giờ ủ ở các mức nhiệt độ khảo sát. - Kết quả khảo sát sự phân hủy keratin. - qua việc phân hủy lông gia súc và gia cầm cho thấy các dòng vi khuẩn phân hủy được từ 14,59% đến 37,76% khối lượng bột lông gia cầm sau một tuần lắc ủ ở các mức nhiệt độ khảo sát. - Ngoài ra, kết quả theo dõi sự làm gãy rụng sợi lông gà sau 10 ngày cũng cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng làm gãy rụng các sợi lông con trên sợi lông gà lớn. - Ba dòng vi khuẩn V1, V2 và V9 cho thấy khả năng phân hủy cơ chất keratin qua việc phân hủy lông hữu hiệu hơn các dòng còn lại. - Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng thủy phân lông vũ. - Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản