Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc - lông gia cầm từ các lò mổ gia súc ở ba huyện Tam Bình, Long Hồ và Vũng Liêm tỉnh Vĩnh Long

- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA SÚC - LÔNG GIA CẦM TỪ CÁC LÒ MỔ GIA SÚC Ở BA HUYỆN TAM BÌNH, LONG HỒ VÀ VŨNG LIÊM TỈNH VĨNH LONG.
- Hàng năm, tại Việt Nam có hàng ngàn tấn lông gia súc, lông gia cầm tha ̉ i ra môi trường mà chưa được xử lý.
- Keratin là thành phần cấu tạo chính của lông gia súc, gia cầm và là hợp chất rất khó bị phân hủy trong tự nhiên.
- Vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh các loại cơ chất chứa keratin này từ mẫu đất, mẫu lông và nước thải thu ở lò giết mổ gia su ́ c thuộc tı ̉ nh Vı nh Long.
- Các mẫu vật ̃ được pha loãng và nuôi cấy trên môi trường chứa bột lông heo như nguồn carbon và nitơ duy nhất để phân lập vi khuẩn..
- Kết quả phân lập được 47 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông heo với đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục.
- Tất ca ̉ các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho hoạt tính keratinase với cơ chất azokeratin ở 50  C sau 15 phút phản ứng.
- Dòng Kr42 có hoạt độ keratinase cao nhất la ̀ 114,3U/ml và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn còn lại.
- Bên cạnh đó, dòng Kr11 va ̀ Kr45 cho kết quả phân hủy lông heo tốt nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lần lượt là 37,66% và 29,41%.
- Do ̀ ng Kr45 co ́ khả năng phân hủy lông gia cầm tô ́ t nhâ ́t v ớ i tỷ lệ 72,79%.
- n đại dựa va ̀ o trình tự của đoạn gen 16S rRNA đa ̃ cho kê ́ t luận dòng vi khuẩn Kr11 co ́ quan hê gâ ̣ ̀n với loa ̀ i Bacillus flexus và do ̀ ng vi khuẩn Kr45 co ́ tương quan gâ ̀n v ớ i loa ̀ i Bacillus megaterium..
- Lông gia súc và lông gia cầm có thành phần chính là keratin rất khó phân hủy và chiếm tỉ lệ khá lớn trong nguồn rác thải từ các lò giết mổ trở thành một nguồn ô nhiễm nghiêm trọng (Gupta và Ramnani, 2006).
- Các nghiên cứu trong nước về vi sinh vật có khả năng phân giải keratin đã đạt được những thành công nhưng số lượng nghiên cứu còn ít và đều tập trung ở phía Bắc-vùng khí hậu khá khác biệt với Đồng bằng sông Cửu Long.
- Do đó, việc phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân huỷ lông gia súc và lông gia cầm từ các lò giết mổ gia súc ở tı̉nh Vı̃nh Long là nghiên cứu cần thiết nhằm tìm kiếm các dòng vi khuẩn phân huỷ lông gia súc, lông gia cầm mạnh để phục vụ cho sản xuất chế phẩm sinh học giúp chế biến nguồn chất thải này thành phân hữu cơ sinh ho ̣c hoă ̣c sản phẩm bổ sung protein với độ hấp thu cao làm thức ăn cho cá, gia súc, gia cầm.
- Các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin được phân lập trên môi trường bột lông và được chọn lọc dựa vào hoạt tính keratinase, khả năng phân hủy lông gia cầm và lông heo.
- Các dòng vi khuẩn tuyển chọn được định danh dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa và trình tự đoạn gen 16S rDNA..
- Cơ chất chứa keratin: bột lông heo, bột lông gia cầm..
- 2.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải keratin trên môi trường bột lông heo:.
- đối với bột lông gia cầm: lông gà và lông vịt được thu tại các lò giết mổ gia cầm tại tỉnh Vĩnh Long, rửa sạch loại bỏ tạp chất, sấy khô, xay nhuyễn, trộn với tỷ lệ 1: 1..
- Cân 1 g mẫu đối với đất, lông hoặc hút 10 ml đối với mẫu nước cho vào bình tam giác 250 ml chứa 99 ml (90 ml đối với mẫu nước) môi trường lỏng có bổ sung bột lông heo ủ ở 30C trên máy lắc (120 vòng/phút) trong vòng 24 giờ nhằm tăng sinh khối các vi khuẩn trong mẫu.
- 2.2.2 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông heo của các dòng vi khuẩn:.
- Đối với mỗi dòng vi khuẩn, chuẩn bị một bình thủy tinh 75 ml chứa 25 ml môi trường bột lông heo với thành phần như môi trường phân lập và được khử trùng ở 121C trong 10 phút.
- Lần lượt chủng vào mỗi bình thủy tinh 1,15 ml dịch nuôi vi khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được, ủ ở 30C trên máy lắc (120 vòng/phút).
- Một bình thủy tinh với cùng thể tích môi trường nhưng không chủng vi khuẩn mà thay bằng 1,15 ml nước cất vô trùng được sử dụng làm mẫu đối chứng.
- ngày nuôi lắc, tiến hành lọc và rửa môi trường qua vải lọc đã được khử trùng và cân khối lượng trước đó, cân lượng bột lông còn lại sau khi đã lọc và sấy khô ở 60C đến khối lượng không đổi để tính khối lượng bột lông đã bị phân hủy trong quá trình nuôi cấy.
- Khả năng phân hủy bột lông heo của vi khuẩn được tính theo công thức sau: (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010).
- là tỉ lệ bột lông heo bị phân hủy bởi vi khuẩn;.
- m BĐ : là khối lượng bột lông ban đầu;.
- m C : là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy..
- 2.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn.
- Thí nghiệm khảo sát khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn phân lập được tiến hành tương tự như khảo sát khả năng phân hủy bột lông heo, nhưng với cơ chất là bột lông gia cầm..
- 2.2.4 Đánh giá hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn.
- Bột lông gia cầm được nghiền thật mịn, cho 1 g vào bình tam giác 100 ml.
- Cho tất cả phần dung dịch trong ống nghiệm 10 ml vào bình tam giác 100 ml có bột lông gia cầm đã chuẩn bị ở trên, trộn đều trong 10 phút.
- Đo hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn trên cơ chất Azo-keratin.
- 2.2.5 Đi nh danh các dòng vi khuẩn được ̣ tuyển chọn.
- Một dòng vi khuẩn thể hiện khả năng phân hủy bột lông gia súc và một dòng vi khuẩn phân hủy bột lông gia cầm mạnh nhất được tuyển chọn và được giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, đối chiếu với dữ liệu trên GenBank bằng công cu ̣ BLAST để xác định mức độ tương đồng về trình tự của đoạn gen này với các dòng vi khuẩn đã được công bố..
- Qui trình được thực hiện như sau: ly trích DNA của vi khuẩn.
- thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi phổ biến (8F – 1391R) dùng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn (Baker et al., 2003) có trình tự như sau:.
- Dựa vào tỉ lệ tương đồng của trình tự đoạn gen 16S rRNA, kết hợp với các đặc tính hình thái và sinh hóa (theo hệ thống phân loa ̣i Bergey) để xác định loài của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn..
- 2.2.6 Khảo sát khả năng phân hủy sợi lông gà của ca ́ c dòng vi khuẩn phân lập được.
- Quan sát và ghi nhận thời gian làm gãy rụng lông đối với dòng vi khuẩn tuyển cho ̣n trong 10 tuần..
- 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn.
- Từ 21 mẫu (7 mẫu đất, 7 mẫu nước, 7 mẫu lông) thu tại các lò giết mổ gia súc ở huyê ̣n Tam Bı̀nh, Long Hồ, Vũng Liêm của tỉnh Vĩnh Long đã phân lập được 47 dòng vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí.
- Tất cả các dòng này đều có khả năng phát triển trên môi trường khoáng cơ bản có bổ sung bột lông heo như nguồn carbon và nitơ duy nhất, chứng tỏ chúng có khả năng sử dụng bột lông heo cho sự phát triển (Daniel et al., 2009).
- Sau khi phân lập ròng, các dòng vi khuẩn được cấy trên môi trường đặc có cùng thành phần để quan sát hình thái khuẩn lạc.
- Thời gian trung bình để tế bào vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là từ 24 – 48 giờ.
- Đặc điểm về hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được mô tả trong Bảng 1..
- Hı̀nh 1: Hình thái khuẩn lạc của dòng vi khuẩn Kr21.
- Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập được.
- Kết quả tính hoạt độ enzyme keratinase của các dòng vi khuẩn được thể hiện trong Hình 2.
- Kết quả cho thấy hầu như tất cả các dòng vi khuẩn đều cho phản ứng với cơ chất azokeratin.
- Trong đó, dòng Kr42 cho hoạt tính cao nhất với 114,33U/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với tất cả các dòng vi khuẩn còn lại.
- Các dòng Kr37, Kr30, Kr24 thuộc nhóm có hoạt độ keratinase thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và thấp hơn khoảng 68 – 114 lần so với dòng cho hoạt tính cao nhất là Kr42..
- Hình 2: Hoạt tính keratinase của các dòng vi khuẩn Ghi chú.
- 3.3 Khả năng phân hủy bột lông heo của các dòng vi khuẩn phân lập được.
- Hı̀nh 3: Khả năng phân hủy bột lông heo của các dòng vi khuẩn Ghi chú.
- ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn..
- Kết quả khảo sát (hı̀nh 3) cho thấy các dòng vi.
- khuẩn phân lập được đều có khả năng phân hủy lông heo sau 7 ngày nuôi cấy với mật số vi khuẩn chủng vào lúc đầu là 4 x 10 11 (CFU/ml).
- Kr11 cho kết quả phân hủy bột lông heo cao nhất 37,66%, kết quả phân hủy này cao gấp khoảng 34,24 lần so với kết quả phân hủy bô ̣t lông heo ở.
- mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn.
- kế đến là dòng Kr45 với tỷ lệ phân hủy bô ̣t lông heo là 29,4% cao gấp 26,73 lần so với tỷ lê ̣ phân hủy bô ̣t lông heo ở mẫu đối chứng.
- tích thống kê cũng cho thấy khả năng phân hủy lông heo của hai dòng này khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% theo phép thử Duncan so với mẫu đối chứng và với tất cả các dòng còn lại..
- 3.4 Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn phân lập được.
- Hình 4: Khả năng phân hủy bột lông gia cầm của các dòng vi khuẩn Ghi chú.
- Hình 4 thể hiê ̣n khả năng phân hủy lông gia cầm của 47 dòng vi khuẩn phân lâ ̣p được.
- Kết quả khảo sát sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy rằng cả 47 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân hủy lông gia cầm.
- Dòng vi khuẩn Kr45 có khả năng phân hủy lông gia cầm mạnh nhất với tỷ lệ là 72,79%.
- và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với mẫu đối chứng và với các dòng còn lại..
- Kết quả thu được thể hiê ̣n khả năng phân hủy lông gia cầm cao hơn hẳn so với khả năng phân hủy lông gia súc hầu như ở tất cả các dòng vi khuẩn tương ứng (Hình 3 và Hı̀nh 4), mặc dù chúng được phân lập từ các lò giết mổ gia súc..
- Điều này cho thấy khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin không chỉ phụ thuộc vào dòng vi khuẩn và hoạt độ enzyme keratinase do chúng tạo ra, mà còn phụ thuộc vào cấu trúc của keratin, chứ không bị ảnh hưởng nhiều từ nguồn phân lập.
- Sự khác biệt về khả năng phân hủy lông gia cầm và khả năng.
- phân hủy lông heo ở các dòng vi khuẩn cũng có thể là do sự khác biệt về cấu trúc keratin giữa lông gia súc (-keratin) và lông gia cầm (-keratin) cũng như hàm lượng sulfur (cầu nối disulfide) trong hai loại cơ chất này (Akhtar và Edwards, 1997)..
- 3.5 Khả năng phân hủy sợi lông gà nguyên của 47 dòng vi khuẩn trong ống nghiệm.
- Kết quả theo dõi sự làm rụng lông con trên sợi lông gà nguyên của 47 dòng vi khuẩn sau 10 ngày nuôi lắc cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng làm gãy rụng lông con trên sợi lông gà nguyên.
- Các dòng còn lại cũng cho thấy khả năng làm rụng lông con từ ngày thứ tư nhưng chưa đến 50% số lông con sau 10 ngày chủng..
- 3.6 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn được tuyển chọn.
- Dòng vi khuẩn Kr11(được phân lâ ̣p từ mẫu đất ở lò giết mổ bò ở huyê ̣n Tam Bı̀nh) phân huỷ lông gia súc ma ̣nh nhất và Kr45 (được phân lâ ̣p từ mẫu lông ở lò giết mổ bò ở huyê ̣n Tam Bı̀nh) phân hủy lông gia cầm ma ̣nh nhất được cho ̣n để đi ̣nh danh.
- Đă ̣c điểm sinh hoá của hai dòng vi khuẩn tuyển cho ̣n được khảo sát để đi ̣nh danh theo phương pháp truyền thống với hê ̣ thống phân loa ̣i Bergey..
- Bảng 2: Kết quả khảo sát đă ̣c diểm của hai dòng vi khuẩn hiếu khı́ được tuyển cho ̣n STT Dòng.
- vi khuẩn.
- Khả năng di động.
- thường xuyên)..
- do ̀ ng dương tı ́ nh.
- do ̀ ng âm tı ́ nh .
- hơ ̣p nhất về các đă ̣c tı́nh sinh hoá của hai dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45..
- Hı̀nh 7: Bo ̣t khı́ sinh ra khi khảo sát hoa ̣t tı́nh catalase của dòng vi khuẩn Kr11 và Kr45.
- Bảng 4: Kết quả mối tương quan di truyền các dòng vi khuẩn phân giải keratin phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI).
- Các dòng vi khuẩn phân lập Đại diện loài có quan hệ gần gũi Mã số Tỉ lệ tương đồng.
- Kết hơ ̣p giữa phương pháp đi ̣nh danh truyền thống Bergey và phương pháp đi ̣nh danh hiê ̣n đa ̣i dựa vào trình tự đoạn gen 16S rDNA của hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn với trình tự của các dòng vi khuẩn khác ở GenBank cho thấy chúng đều thuộc chi Bacillus , dòng Kr11 có quan hê ̣ gần gũi với Bacillus flexus RB85, dòng Kr45 tương quan gần với dòng Bacillus megaterium AIMST 3..
- Như vậy, hai dòng vi khuẩn được tuyển chọn từ nghiên cứu này đều thuộc chi Bacillus.
- (2007) là phần lớn các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy keratin cao phân lập được đều thuộc chi Bacillus..
- Dòng Bacillus megaterium F7-1 đã được Geun - Tea Park và Hong – Joo Son nghiên cứu và cho thấy khả năng phân hủy đến 26% lượng bột lông gà sau 24 giờ chủng ở 30°C..
- Từ chất thải lò giết mổ gia súc đã phân lập được vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc (lông heo) và lông gia cầm.
- Khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin không chỉ phụ thuộc vào hoạt tính keratinase mà còn phụ thuộc vào các yếu tố khác (có thể là tế bào vi khuẩn và kiểu cấu trúc keratin, Edward et al.
- Trong thı́ nghiê ̣m, hai dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông heo ma ̣nh (Bacillus flexus Kr11) và lông gia cầm mạnh (Bacillus megaterium Kr45) đều thuộc chi Bacillus, kỳ vọng ứng dụng để xử lí rác thải chứa keratin..
- Dòng vi khuẩn Kr45 liên quan gần với loài Bacillus megaterium với khả năng phân hủy co ̣ng.
- lông gà nguyên hoàn toàn sau 10 tuần có tiềm năng đưa vào thử nghiệm ứng dụng phân hủy lông gia cầm ở điều kiện môi trường tự nhiên để làm thức ăn chăn nuôi..
- Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản