- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN. - Đề tài nghiên cứu gồm các nội dung phân lập vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men và sản phẩm men tiêu hóa đông khô, kiểm tra khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn, H 2 O 2 và bacteriocin từ các dòng phân lập bằng hai phương pháp nhỏ giọt và khuếch tán trên giếng thạch kết hợp với vi khuẩn chỉ thị Bacillus subtilis, định danh cấp độ giống các dòng phân lập có hoạt tính kháng khuẩn dựa trên khảo sát sự phát triển của vi khuẩn ở các mức độ khác nhau của nhiệt độ, pH, NaCl, NaN 3 , manitol, khả năng sinh khí khi lên men đường glucose và thử nghiệm indole. - Kết quả phân lập được 46 dòng vi khuẩn lactic. - và được kiểm tra tính kháng khuẩn. - 23 dòng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị B. - subtilis, trong đó 10 dòng có khả năng tổng hợp bacteriocin. - nhận có tính kháng khuẩn mạnh nhất. - Kết quả nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy vi khuẩn lactic không những có thể lên men lactic rau quả mà còn có những tác động hiệu quả trong bảo quản thực phẩm. - Đặc tính của vi khuẩn lactic là Gram dương, oxydase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử (Abee et al., 1999). - Hệ vi sinh vật này là một trong những nguồn vi sinh vật sinh ra bacteriocin, dạng chất kháng khuẩn có khả năng chống lại sự phát triển của các mầm bệnh và được ứng dụng như chất bảo quản thực phẩm. - Hầu hết vi khuẩn lactic đều tổng hợp được bacteriocin nên thành phần kháng khuẩn này rất đa dạng như Lactacin, Nisin, Acidolin. - Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số sản phẩm men tiêu hoá đông khô. - Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu bước đầu phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nguồn sản phẩm lên men và các sản phẩm men tiêu hoá đông khô có sẵn trên thị trường. - Qua đó có thể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩn cao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực phẩm tự nhiên.. - Nguyên liệu: Dưa cải muối chua, kim chi, sữa chua Vinamilk, sữa chua uống Yakult, nước tàu hủ, nem chua, sản phẩm men tiêu hoá đông khô (Lactominplus, Bioacimin, Zincibio, Antibio, Probio và Probactil).. - Môi trường nuôi cấy và phân lập: MRS agar, MRS broth và nước mắm - peptone.. - Sữa chua Vinamilk, Yakult, Kefir và các mẫu sản phẩm lên men bao gồm kim chi, dưa cải muối chua, nem chua được thu thập tại siêu thị Coopmart. - Sản phẩm men tiêu hoá đông khô Lactominplus, Bioacimin, Zincibio, Antibio, Probio và Probactil được thu thập tại nhà thuốc tây. - 2.2.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ men tiêu hóa và thực phẩm lên men. - Sản phẩm men tiêu hoá đông khô và các mẫu thực phẩm được đồng hóa, hòa tan vào môi trường MRS broth và ủ ở 37 o C trong 24 giờ. - Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn lactic. - Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, không màu, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy. - Sau khi được tách ròng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học. - Vi khuẩn lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính và phân giải được CaCO 3. - 2.2.3 Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao Tính kháng khuẩn được kiểm tra bằng hai phương pháp chuyển đổi từ phương pháp “agar spot” (nhỏ giọt) và “well diffusion agar” (khuếch tán trên giếng thạch) của Herna´ndez et al. - Vi khuẩn chỉ thị trong thí nghiệm này là Bacillus subtilis đã được phân lập thuần từ Biosubtyl II.. - Những dòng vi khuẩn lactic phân lập được nuôi trong 5ml MRS lỏng ở 30 o C trong 16 giờ. - Tiến hành ủ các mẫu đã nhỏ giọt vi khuẩn lactic ở 30 o C trong 18 giờ. - Trộn và phủ môi trường bán đặc chứa vi khuẩn chỉ thị B. - subtilis lên đĩa đã có chứa những dòng vi khuẩn lactic phát triển. - Quan sát và ghi nhận kích thước vùng sáng vô khuẩn xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn lactic.. - Chủng 10% dung dịch vi khuẩn này vào môi trường nước mắm - peptone 2% agar ở 50 o C và tiến hành đổ đĩa. - Những dòng vi khuẩn lactic đã phát triển trong 2ml MRS lỏng dưới điều kiện yếm khí trong 48 giờ, ly tâm 8.000rpm trong 15 phút ở 4 o C. - Thu được dung dịch có khả năng có bacteriocin thô.. - Sau đó, đĩa được ủ ở 35 o C cho vi khuẩn chỉ thị phát triển.. - Xác định và chọn lọc tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic. - Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn lactic phân lập được tính bằng đường kính vòng vô khuẩn quanh khuẩn lạc hay quanh miệng giếng trên đĩa. - Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi đường kính vòng vô khuẩn rộng hơn 2mm. - So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng và chọn lọc nhũng dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao.. - 2.2.4 Định danh cấp độ giống của những dòng vi khuẩn lactic đã chọn lọc. - Vi khuẩn lactic được xác định ở mức độ giống dựa vào phương pháp hình thái học của Axelsson (2004) và một số phản ứng sinh hóa đặc trưng. - Kiểm tra khả năng sinh khí CO 2 khi lên men đường glucose, khảo sát sự phát triển của vi khuẩn ở 10 và 45 o C. - 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ men tiêu hóa và thực phẩm lên men. - 46 dòng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ 7 loại sản phẩm lên men (sữa chua Vinamilk, Yakult, kim chi, dưa chua, Kefir, nem chua, nước chua tàu hủ) và 6 loại men tiêu hóa đông khô. - Các dòng phân lập được quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi. - Kết quả cho thấy là vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính, không sinh bào tử và có khả năng phân giải CaCO 3 . - Nguồn mẫu thu thập, ký hiệu các dòng phân lập và các đặc điểm hình thái của 46 dòng vi khuẩn được trình bày trong bảng 1.. - Bảng 1: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic. - Nguồn phân lập Dòng phân lập Hình thái tế bào vi khuẩn Sản phẩm men tiêu hóa. - Que ngắn. - Que ngắn hơi cong Cầu đơn. - Cầu đôi Que ngắn. - Que ngắn hơi cong Que ngắn. - Que ngắn Que dài. - Bên cạnh những dòng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu thực phẩm lên men đã được xác định sơ bộ thuộc hệ vi khuẩn lactic, các dòng vi khuẩn lactic được tách ròng từ sản phẩm men tiêu hóa đông khô cũng đã được xác định ở cấp độ loài rõ ràng hơn. - Vi khuẩn lactic từ Bioacimin của Công ty Visgerpharm, dòng lactic Bio1 và Bio3 đã được phân lập và có đặc tính hình thái phù hợp với Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecalis trong sản phẩm. - Ba dòng vi khuẩn lactic từ Lactominplus (Công ty RexGene Biotech, Hàn Quốc) bao gồm: Lac là Streptococcus faecalis, Lac3 là Lactobacillus acidophilus và Lac1 là Bifidobacterium longum. - Một dòng vi khuẩn lactic được tách ròng từ Zincibio (Công ty Intechpharm, Việt Nam) là Streptococcus thermophilus.. - Tuy những dòng vi khuẩn lactic được phân lập giống nhau về những đặc tính cơ bản nhưng chúng khác nhau về hình dạng khuẩn lạc, tế bào và nguồn gốc mẫu phân lập, chứng tỏ rằng hệ vi khuẩn lactic sống khắp nơi và đa dạng về loài và đặc trưng cho từng sản phẩm lên men.. - 3.2 Xác định và chọn lọc những dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt cho thấy sau 24 giờ, những vùng sáng xung quanh bề mặt vi khuẩn lactic đã xuất hiện trên đĩa. - Qua bảng 2 cho thấy trong 46 dòng vi khuẩn đã được kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp nhỏ giọt, có 23 dòng thể hiện khả năng tính kháng khuẩn, trong đó 7 dòng có tính kháng mạnh với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 10mm, 11 dòng có tính kháng trung bình với đường kính vòng vô khuẩn 5 - 10mm và 5 dòng có tính kháng yếu với đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn 5mm. - Qua phương pháp này cho thấy hoạt tính của các thành phần kháng khuẩn có sẵn trong tế bào vi khuẩn lactic sẽ có tác động kháng lại vi khuẩn khác. - Theo Ouwehand và Satu Vesterlund (2004), tế bào vi khuẩn lactic đã chứa sẵn các hợp chất có tính kháng khuẩn như reuterin, reutericyclin, acid 2-Pyrrolidone-5-carboxylic và khi chúng sinh trưởng đã tạo ra thêm những thành phần kháng khuẩn khác bao gồm acid lactic, bacteriocin, CO 2 , H 2 O 2 và diacetyl.. - Bảng 2: Khả năng kháng B. - subtilis của các dòng vi khuẩn acid lactic. - STT Mẫu Vòng vô khuẩn (mm) Tính kháng khuẩn. - 2 Mức độ xuất hiện khả năng tính kháng khuẩn. - Hình 1: Vòng kháng khuẩn mạnh (A3), trung bình (KC4) và yếu (Zin). - Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của 23 dòng thể hiện hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên giếng cho thấy 10 dòng vi khuẩn có xuất hiện vùng sáng vô khuẩn với kích thước khác nhau. - Trong đó, 4 dòng phân lập có tính kháng khuẩn lớn hơn 10mm, nên thể hiện tính kháng mạnh hơn những dòng còn lại. - Tiêu biểu, dòng DC213A có đường kính vòng sáng rộng nhất là 22mm, do đó thể hiện tính kháng mạnh nhất. - Bên cạnh đó có 5 dòng đã cho vòng vô khuẩn nằm trong khoảng 5 - 10mm, biểu hiện tính kháng khuẩn ở mức trung bình. - Dòng Zin có vòng kháng khuẩn rất nhỏ (4mm) nên tính kháng khuẩn rất yếu. - Như vậy, những dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu dưa cải muối chua và men vi sinh đông khô có tính kháng khuẩn của bacteriocin mạnh hơn các dòng phân lập từ nhiều nguồn khác. - Tính kháng khuẩn bacteriocin của các dòng được trình bày trong Bảng 3. - Bảng 3: Kết quả tính kháng khuẩn của bacteriocin từ dòng phân lập. - Hình 2: Vòng kháng khuẩn từ bacteriocin của các dòng vi khuẩn lactic a: Dòng Zin kháng khuẩn yếu. - b: Dòng Probio kháng khuẩn trung bình. - c: Dòng DC213A kháng khuẩn mạnh. - Qua hai phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn, kết luận có 23 dòng vi khuẩn lactic biểu hiện kháng vi khuẩn chỉ thị Bacillus subtilis, trong đó có 10 dòng sinh ra chất bacteriocin để chống lại vi khuẩn chỉ thị. - Vì vậy, 10 dòng vi khuẩn đã tổng hợp bacteriocin này được tiếp tục tuyển chọn để định danh ở cấp độ giống.. - 3.3 Định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn được chọn lọc. - Sử dụng 10 dòng vi khuẩn lactic đã được tuyển chọn để định danh ở mức độ giống dựa vào phương pháp hình thái học, các thử nghiệm sinh hóa và khả năng phát triển ở các điều kiện khác nhau. - Trong 10 dòng này có 4 dòng từ sản phẩm men tiêu hóa đã được xác định từ thí nghiệm trên, bao gồm: Probio, Lac3 và Anti là Lactobacillus acidophilus và Zin là Streptococcus thermophiplus. - Vì vậy, các thí nghiệm khảo sát sự phát triển chỉ thực hiện với 6 dòng phân lập từ dưa chua và kết quả được trình bày ở bảng 4.. - Bảng 4: Kết quả sự phát triển của các dòng vi khuẩn acid lactic sinh bacteriocin. - Bổ sung 0,04% NaN 3 Khả năng sinh indole. - Sự phát triển của 10 dòng vi khuẩn lactic trong các điều kiện khác nhau (Bảng 4) được so sánh với phương pháp phân loại ở mức độ giống vi khuẩn lactic của Axelsson (2004). - Bảng 5: Kết quả định danh các dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin STT Dòng. - phân lập. - Hình thái. - trơn lồi, bìa nguyên Que ngắn Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Chi: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus. - trơn lồi, bìa nguyên Que ngắn 3 Lac3 Trắng đục, bề mặt. - trơn lồi, bìa nguyên Que ngắn hơi cong. - trơn lồi, bìa nguyên Que ngắn. - Que ngắn hơi cong. - Từ 7 loại sản phẩm thực phẩm lên men và 6 loại sản phẩm men tiêu hóa đã phân lập thu được 46 dòng vi khuẩn có các đặc tính thuộc hệ vi khuẩn lactic: Gram dương, catalase và oxydase âm tính, không có nội bào tử và có khả năng sinh phân. - đó 10 dòng có khả năng sinh bacteriocin kháng lại vi khuẩn chỉ thị Bacillus subtilis và dòng DC213A biểu hiện tính kháng khuẩn mạnh nhất. - 10 dòng có tính kháng khuẩn của bacteriocin được tuyển chọn định danh. - Có 3 dòng vi khuẩn từ các sản phẩm men tiêu hóa Antibio, Probio và Lac3 thuộc loài Lactobacillus acidophilus và một dòng từ men Zincibio thuộc loài Streptococcus thermophilus.