- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM Ở RUỘNG LÚA TỈNH ĐỒNG THÁP Nguyễn Thị Hạnh Nguyên 1* và Nguyễn Hữu Hiệp 2. - Cố định đạm, Lyngbya aestuarii, ruộng lúa, sinh khối, vi khuẩn lam. - Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm từ mẫu đất và nước ở một số ruộng lúa thuộc tỉnh Đồng Tháp để ứng dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh. - Kết quả phân lập được 10 dòng đơn bào thuộc 5 chi Synechocystis, Gloeocapsa, Chroococcus, Microcystis, Aphanocapsa và 20 dòng dạng sợi thuộc 4 chi Microcoleus, Lyngbya, Phormidium, Oscillatoria. - Kết quả khảo sát sự tăng trưởng của các dòng vi khuẩn lam này trên môi trường không đạm BG11 trong 30 ngày cho thấy 4 dòng vi khuẩn lam đơn bào (HN4, HN11, HN10 và LV4) đạt mật số cao hơn ban đầu (từ 6,6 – 7,1 log 10 cell /mL so với 5,9 log 10. - cell/mL ban đầu), 6 dòng vi khuẩn lam dạng sợi (LVO2, HN7, HN3, HN5, LV5, LV9) đạt sinh khối khô cao gấp 5,6 – 7,2 lần so với lượng ban đầu (tương ứng từ g/50mL so với 0,05 g/50mL ban đầu). - Dựa vào đặc điểm hình thái và kết quả giải trình tự gen 16S rRNA, dòng vi khuẩn lam triển vọng LV5 có độ tương đồng 90% với loài vi khuẩn lam Lyngbya aestuarii PCC 7419.. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lam (cyanobacteria) có khả năng cố định đạm ở ruộng lúa tỉnh Đồng Tháp. - Vi khuẩn lam là một trong những nhóm sinh vật xuất hiện rất sớm trên Trái đất và hầu như có mặt ở tất cả các hệ sinh thái (Summons et al., 1999). - Vi khuẩn lam được mô tả như là các vi sinh vật nhân sơ quang tự dưỡng có chứa diệp lục tố. - Hình dạng tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn lam rất đa dạng như hình cầu, hình thoi hay hình ống. - Cấu tạo cơ thể có thể là đơn bào hay đa bào dạng sợi. - Nhiều vi khuẩn lam dạng sợi hay đơn bào tổng hợp các enzyme nitrogenase và có thể cố định được nitrogen tự do thành ammonium N-NH 4. - Khả năng cố định đạm được ghi nhận ở những vi khuẩn lam có dị bào như Nostoc, Anabaena, Aulosira hay ở một số loài đơn bào như Gloeocapsa, Aphanothece, Gloeothece và cả ở một số loài vi khuẩn lam dạng sợi không có dị bào Oscillatoria và Plectonema ( Issa et al., 2014).. - Chi vi khuẩn lam đơn bào Gloeothece đã được nghiên cứu rộng rãi cho thấy hoạt động của enzyme nitrogenase và quang hợp tạo oxy vẫn cùng tồn tại trong một loại tế bào đơn. - (1979), loài vi khuẩn lam dạng sợi không dị bào Microcoleus chthonoplastes vẫn có khả năng cố định đạm. - Vi khuẩn lam có thể đóng góp khoảng 20 – 30 kg N/ha/vụ canh tác cho đất lúa.. - Thông thường, việc sử dụng vi khuẩn lam sống tự do được ưa chuộng ở các vùng nhiệt đới và được áp dụng ở hầu hết các nước châu Á. - Ngoài lúa, các cây trồng khác như: rau, lúa mì, lúa miến, ngô, bông, mía cũng đáp ứng với phân sinh học vi khuẩn lam. - Một trong những giải pháp được đề ra để nâng cao chất lượng đất thoái hóa là sử dụng các chế phẩm vi sinh cụ thể là vi sinh cố định đạm. - Với khả năng cố định đạm đã được ghi nhận, vi khuẩn lam là ứng viên tiềm năng cho việc sản xuất chế phẩm vi sinh để cải thiện năng suất cây trồng cũng như nâng cao sức khỏe đất một cách bền vững.. - 2.2.1 Phân lập, quan sát đặc điểm hình thái và phân loại vi khuẩn lam cố định đạm. - Môi trường BG11 đã được bổ sung 50 mg/L cycloheximide + 5 mg/L kanamycin (Katoh et al., 2014) để hạn chế sự phát triển của nấm và vi khuẩn khác trong mẫu ban đầu. - Sau khoảng 10 – 14 ngày, sinh khối vi khuẩn lam xuất hiện trên bề mặt đất hay trong nước thành những mảng màu xanh, dùng que cấy đã khử trùng gạt lấy vi khuẩn lam và chuyển vào đĩa Petri khác có lót giấy lọc với dung dịch môi trường BG11 không đạm. - Sau 7 – 10 ngày, các vi khuẩn lam có khả năng phát triển trên môi trường BG11 không đạm sẽ được cấy chuyền sang đĩa Petri mới. - Tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn lam thuần khiết sử dụng phương pháp phân lập tế bào đơn bằng micropipette (Andersen and Kawachi, 2005). - Phân loại vi khuẩn lam dựa vào đặc điểm hình thái và khóa phân loại Desikachary (1959).. - Bảng 1: Thành phần môi trường BG11 (Rippka et al., 1979). - Môi trường BG11*. - *Trường hợp pha môi trường BG11 không đạm thì không bổ sung NaNO 3. - 2.2.2 Khảo sát khả năng tăng trưởng của các dòng vi khuẩn lam trong môi trường không đạm. - Đối với vi khuẩn lam dạng sợi: cân 0,05 g sinh khối khô vi khuẩn lam cho vào cốc có đậy nắp chứa 50 mL môi trường BG11 không đạm. - Xác định sinh khối khô của vi khuẩn lam vào ngày thứ 10, 20 và. - Sinh khối vi khuẩn lam được lọc bằng giấy lọc, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó được cân và ghi nhận số liệu. - Đối với vi khuẩn lam dạng đơn bào: cho dung dịch vi khuẩn lam (mật số 5,9 log 10 tế bào/mL) vào cốc có đậy nắp chứa môi trường BG11 không đạm với tỷ lệ 20%. - Tiến hành xác định mật số của vi khuẩn lam bằng buồng đếm hồng cầu vào ngày thứ 10, 20 và 30 sau khi nuôi. - Do đặc tính phát triển của hai dạng vi khuẩn lam dạng sợi và đơn bào không giống nhau nên áp dụng phương pháp đo sinh khối khác nhau cho mỗi dạng.. - Vi khuẩn lam đơn bào sau khi nuôi 30 ngày trong thí nghiệm nhận thấy khối lượng sinh khối rất nhỏ nên chọn cách thức đo mật độ tế bào để so sánh trong cùng dạng đơn bào.. - 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn lam cố định đạm lên sự tăng trưởng của lúa trong điều kiện in vitro. - Tiếp theo, chọn các hạt nảy mầm tương đối bằng nhau về chiều dài rễ cũng như thân mầm để ngâm trong sinh khối vi khuẩn lam (được nuôi cấy sau 30 ngày) trong 6 giờ.. - Thí nghiệm lặp lại 3 lần với mỗi dòng vi khuẩn lam.. - Đối chứng âm (ĐC-) không bổ sung đạm: hạt lúa đã nảy mầm được ngâm trong 10 mL dung dịch môi trường BG11 không đạm;. - Đối chứng dương (ĐC+) có bổ sung đạm: hạt lúa đã nảy mầm được ngâm trong 10 mL dung dịch môi trường BG11 với lượng đạm 1,5 g/L.. - 2.2.4 Định danh các vi khuẩn lam cố định đạm bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Các dòng vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm cao được ly trích DNA (Fiore et al., 2000), tiến hành phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) đoạn gene 16SrDNA với cặp mồi có trình tự mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ và mồi. - 3.1 Kết quả phân lập, quan sát đặc điểm hình thái và phân loại vi khuẩn lam cố định đạm. - Nghiên cứu đã phân lập được 30 dòng vi khuẩn lam từ 36 mẫu đất và nước thu tại 3 huyện thuộc tỉnh Đồng Tháp. - Tất cả 30 dòng vi khuẩn lam đều có khả năng phát triển trên môi trường BG11 không đạm, trong đó có 20/30 dòng dạng sợi và 10/30 dòng dạng đơn bào.. - Kích thước tế bào của các dòng vi khuẩn lam đơn bào dao động từ µm. - Bề rộng trichome của các dòng vi khuẩn lam dạng sợi dao động từ µm. - Đa số các dòng vi khuẩn lam (8 đơn bào và 17 dạng sợi) đều có đặc điểm tế bào có bao, các dòng vi khuẩn lam không có bao chiếm ít hơn (2 đơn bào và 3 dạng sợi). - Về màu sắc, các dòng vi khuẩn lam có màu sắc từ vàng xanh, xanh nhạt đến xanh đậm hay xanh đen. - Các dòng vi khuẩn lam dạng sợi HN3, HN6, LV3, LV6, LVO2 khi phát triển nhận thấy có lớp nhầy trên bề mặt so với những dòng còn lại. - Sự khác biệt về màu sắc của các dòng vi khuẩn lam có thể do tỷ lệ các sắc tố của chúng khác nhau.. - Vi khuẩn lam có chứa hai sắc tố phicocianin (màu lam) và phicoerythrin (màu đỏ) khác nhau ở vài chi tiết trong quang phổ hấp thu. - Hai sắc tố ấy đi đôi theo thành phần thay đổi tùy loài và tùy môi trường nên vi khuẩn lam có màu thay đổi. - Trong thí nghiệm, các dòng vi khuẩn lam được nuôi trong cùng điều kiện môi trường nên sự khác nhau về màu sắc có thể cho thấy chúng thuộc những loài khác nhau.. - Từ các đặc điểm hình thái đã ghi nhận kết hợp với khóa phân loại của Desikachary (1959) các dòng vi khuẩn lam được phân loại như sau: ba mươi dòng vi khuẩn lam đã phân lập được thuộc lớp Cyanophyceae. - 10 dòng đơn bào thuộc lớp phụ 1:. - Kết quả phân loại đến chi cho thấy, 30 dòng vi khuẩn lam thuộc 9 chi được tóm tắt cụ thể trong Bảng 2.. - Bảng 2: Kết quả phân loại các dòng vi khuẩn lam. - STT Dạng Dòng vi khuẩn lam Chi. - Đơn bào. - Dạng sợi. - Hình 1: Đặc điểm vi thể một số dòng vi khuẩn lam quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40×. - Trong kết quả nghiên cứu, không có dòng vi khuẩn lam cố định đạm có dị bào được phân lập (Hình 1). - Điều này có thể do các mẫu chỉ được thu thập vào một mùa nên sự đa dạng của các loài vi khuẩn lam bị hạn chế (Watanabe, 1961). - Tuy nhiên, các dòng vi khuẩn lam cố định đạm đơn bào và dạng sợi không có dị bào đã phân lập được cũng thuộc các chi vi khuẩn lam cố định đạm đã được ghi nhận như:. - 3.2 Kết quả khảo sát khả năng tăng trưởng các dòng vi khuẩn lam trong môi trường không đạm. - Trong môi trường BG11 lỏng không đạm, mật số vi khuẩn lam đơn bào và sinh khối khô vi khuẩn lam dạng sợi đều tăng dần sau thời gian 10 ngày, 20 ngày và cao nhất vào 30 ngày sau khi nuôi. - Ở ngày thứ 30, 4 dòng vi khuẩn lam đơn bào LV03, LV4, HN10, HN11 và HN4 đạt mật độ từ log 10. - tế bào/mL (Bảng 3) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng đơn bào còn lại.. - Bảng 3: Mật độ tế bào của các dòng vi khuẩn lam đơn bào sau 10, 20 và 30 ngày nuôi cấy Ký hiệu Mật độ tế bào (log 10 tế bào/mL). - Bảng 4: Sinh khối trung bình của các dòng vi khuẩn lam dạng sợi sau 10, 20 và 30 ngày nuôi cấy. - Ở nhóm vi khuẩn lam dạng sợi, 6 dòng đạt sinh khối khô cao khác biệt có ý nghĩa là: LV9, LV5, HN5, HN3, HN7, LVO2 trong khoảng từ g/50mL tăng 5,6 – 7,2 lần so với lượng sinh khối bổ sung ban đầu 0,05 g/50mL (Bảng 4).. - năng tăng trưởng của các dòng vi khuẩn lam đạt sinh khối lần lượt là g/50mL) và g/50mL).. - 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn lam cố định đạm lên sự tăng trưởng của lúa trong điều kiện in vitro. - Tiến hành thí nghiệm và so sánh thống kê riêng biệt cho từng nhóm vi khuẩn lam đơn bào và dạng sợi nhằm chọn được cả hai dạng cho kết quả tốt. - Ở mỗi chỉ tiêu ghi nhận, các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn lam và ĐC+ đều cho kết quả cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức không bổ sung đạm và nghiệm thức nước cất. - Từ số liệu thu nhận được (Bảng 5 và Bảng 6), nghiệm thức có vi khuẩn lam HN11, HN4 và dạng sợi LV5 cho kết quả tốt nhất. - Đây có thể là các dòng vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm tiềm năng cho việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh.. - Với các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn lam, cây lúa phát triển tốt, lá xanh, thân cây vươn cao tương tự như ở nghiệm thức có bổ sung đạm. - Điều này chứng tỏ nhiều dòng vi khuẩn lam cố định đạm cả dạng đơn bào và dạng sợi có ảnh hưởng tốt, hỗ trợ cho quá trình tăng trưởng của cây lúa. - Các dòng vi khuẩn dạng sợi: HN3, HN5, LV5 và đơn bào:. - Kết quả này tương tự như nghiên cứu về ảnh hưởng của vi khuẩn lam cố định đạm lên cây lúa của Nguyễn Hồng Ái Vy (2015). - Từ kết quả khảo sát ở cả hai nhóm vi khuẩn lam đơn bào và dạng sợi, 3 dòng vi khuẩn lam cho kết quả tốt nhất là: HN11, HN4 và LV5 được chọn để tiến hành định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử.. - Bảng 5: Ảnh hưởng của vi khuẩn lam đơn bào lên sự tăng trưởng của lúa. - Bảng 6: Ảnh hưởng của vi khuẩn lam dạng sợi lên sự tăng trưởng của lúa Nghiệm. - 3.4 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn lam bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - (1974) từ bề mặt bùn ở Mexico đã phân lập được 3 chi vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm Calothrix, Anabaena và Lyngbya – sau này được biết đến là Lyngbya aestuarii.. - Pott và cộng sự (1979) nhận thấy rằng, thảm vi khuẩn lam dạng sợi không dị bào bao gồm: Lyngbya aestuarii, Phormidium sp., Hydrocoleus sp., Hyella balani và Schizothrix sp. - cho tỉ lệ cố định nitrogen cao hơn cả Scytonema và Calothrix. - Lyngbya aestuarii cũng đã được báo cáo là có khả năng cố định đạm hiếu khí trong nghiên cứu của Paerl và cộng sự (1991). - Bên cạnh đó, trong một số nghiên cứu, loài vi khuẩn lam Lyngbya aestuarii PCC 7419 được ghi nhận là có mang gene nif – một gene liên quan tới sự cố định đạm (Woebken et al., 2015).. - Từ 36 mẫu đất và nước thu tại các ruộng lúa tỉnh Đồng Tháp, đề tài phân lập được 30 dòng vi khuẩn lam có khả năng phát triển trên môi trường BG11 không đạm, trong đó có 10 dòng vi khuẩn lam có tạo sinh khối cao nhất trên môi trường không đạm. - Các dòng này có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của lúa ở các chỉ tiêu chiều cao cây, chiều dài rễ, khối lượng cây và khối lượng rễ. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lam có khả năng cố định đạm trong đất trồng lúa huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp.. - Phân lập một số chủng vi khuẩn lam có tế bào dị hình trong đất trồng lúa huyện Hưng Nguyên và nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng, phát triển