- Cây Chùm ngây, kháng khuẩn, phân lập, tuyển chọn, vi khuẩn nội sinh. - Việc nghiên cứu tập đoàn vi khuẩn nội sinh có khả năng sản xuất những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên trong cây dược liệu đang mở ra hướng giải quyết mới. - Trên cơ sở đó, đề tài phân lập vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng khuẩn trong cây Chùm ngây (Moringa oleifera) được thực hiện. - Vi khuẩn nội sinh được phân lập từ mẫu cây chùm ngây được trồng tại huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp. - Khả năng kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn này được khảo sát đối với ba loài vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila, Escherichia coli và Staphylococcus aureus bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc. - Kết quả ghi nhận được 19/35 dòng có khả năng kháng ít nhất một trong ba loài vi khuẩn gây bệnh. - Các dòng được tuyển chọn nổi bật là dòng C3.3 và C1.4 có khả năng kháng lại cả ba loài vi khuẩn gây bệnh. - Kết quả nhận diện hai dòng vi khuẩn nầy lần lượt là Bacillus subtilis NBT-15 và Bacillus megaterium S1 với độ tương đồng cao (98%).. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng khuẩn trong cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) tại huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp.. - Để giải quyết các vấn đề trên, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm khai thác khả năng kháng khuẩn các chủng vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu. - Theo một nghiên cứu mới đây, dịch ly tâm môi trường nuôi cấy của các dòng vi khuẩn Lactobacillus sp. - có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli (Poppi et al., 2015). - Trên cơ sở đó, đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và định danh được một số dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây chùm ngây có khả năng kháng khuẩn tốt.. - Ba dòng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus sub. - Vi khuẩn Aeromonas hydrophila do Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ cung cấp.. - Chuyển vi khuẩn. - từ pellicle lên môi trường PDA và tiếp tục phân lập cho đến khi thu được các dòng vi khuẩn ròng (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).. - 2.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch vi khuẩn nội sinh. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch vi khuẩn nội sinh đã phân lập được đối với 3 loại hại khuẩn Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc (Bauer el al., 1966).. - Trải vi khuẩn gây bệnh E.coli lên bề mặt đĩa môi trường. - 2.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ly tâm không chứa vi khuẩn nội sinh. - Tiến hành ly tâm dung dịch nuôi cấy, loại bỏ tế bào vi khuẩn nội sinh và khảo sát tính kháng khuẩn của dịch ly tâm không chứa vi khuẩn với 3 loại vi khuẩn gây bệnh nhằm xác định chất kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh trong cây Chùm ngây là có phải hợp chất ngoại bào. - 2.5 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của tế bào vi khuẩn nội sinh. - Thí nghiệm được tiến hành tương tự với tế bào vi khuẩn sau khi được ly tâm tách môi trường nuôi cấy nhằm xác định khả năng kháng khuẩn khi vi khuẩn có mặt trong môi trường. - 2.6 Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn. - Sau khi phân lập, các dòng vi khuẩn nội sinh có tính kháng khuẩn tốt nhất được tiến hành phản ứng Polymerase chain reaction với mồi 16S rRNA, giải trình tự và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI để định danh (Lane, 1991). - 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh Từ rễ, thân, lá và củ của cây Chùm ngây được trồng tại huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp, 35 dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập trên môi trường PDA. - Quan sát trên kính hiển vi cho thấy, đa số các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng que ngắn (19/35) và que dài (13/35), một số dòng còn lại có dạng chuỗi, có 22/35 dòng có khả năng di chuyển. - 3.2 Kết quả khảo sát tính kháng khuẩn Sau khi thử tính kháng khuẩn của 35 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được với ba loài vi khuẩn gây bệnh (Escherichia coli, Aeromonas hydrophila và Staphylococcus aureus), kết quả ghi nhận được tổng số 19/35 dòng vi khuẩn thể hiện tính kháng khuẩn. - Trong tổng số 19 dòng có tính kháng khuẩn, có 10 dòng được phân lập từ củ chiếm 54% số dòng vi khuẩn có tính kháng. - Đặc biệt, hai dòng vi khuẩn C3.3 và C4.1 có khả năng kháng lại cả 3 loài vi khuẩn gây bệnh.. - Bảng 1: Tỷ lệ các dòng vi khuẩn nội sinh có tính kháng khuẩn. - Vi khuẩn gây bệnh. - Số dòng vi khuẩn có tính kháng. - Hình 1: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn E. - coli 3.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli. - Dựa vào số liệu ghi nhận qua 3 ngày quan sát, các dòng vi khuẩn nội sinh có vòng tròn kháng khuẩn có đường kính giảm mạnh so với ngày 2, trừ dòng V4.1 và L4.1 đường kính vòng kháng vẫn tiếp tục tăng. - Có thể do các dòng vi khuẩn nội sinh phát triển nhanh nên môi trường dần hết chất dinh dưỡng vì vậy chúng không tiết ra chất kháng khuẩn trong khi vi khuẩn gây bệnh vẫn tiếp tục phát triển nên vòng kháng khuẩn có giảm đi. - Nhìn chung, qua 3 ngày quan sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh đường ruột E. - coli, kết quả ghi nhận được 9 dòng vi khuẩn sống nội sinh ở các bộ phận của cây Chùm ngây có khả năng kháng E. - Kết quả tương tự được tìm thấy ở các dòng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. - phân lập từ cây rau cần dầy lá có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. - dòng vi khuẩn nội sinh 24giờ 48giờ 72 giờ. - 3.2.2 Khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus. - Kết quả thí nghiệm ghi nhận được có 9 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng khuẩn đối với S.. - Tuy nhiên, khả năng cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh giảm theo thời gian. - Hình 2: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh với Staphylococcus aureus Quan sát sau 48 và 72 giờ ủ, các dòng T3.3. - Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng. - Dòng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium phân lập từ lá cây rau cần dầy lá có khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 29212 (El-Deeb et al., 2013).. - Hình 3: Khả năng kháng khuẩn của dòng C1.4 với vi khuẩn gây bệnh S.aureus qua 24, 48, 72h 3.2.3 Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas. - Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (vi khuẩn gây bệnh ở cá), kết. - quả có 13/35 dòng vi khuẩn có khả năng tạo vòng vô khuẩn (Hình 4), đa số là các dòng có nguồn gốc từ củ. - dòng vi khuẩn 24 giờ 48 giờ 72 giờ. - Nhóm thứ hai, gồm các dòng thể hiện tính kháng khuẩn giảm dần (dòng C1.1, L1.3, C1.3, C1.4, C1.6, C3.3 và C1.5) các dòng vi khuẩn này có khả năng cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh yếu dần và bị tấn công thu hẹp vòng kháng khuẩn dần sau 3 ngày.. - Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh đã cho thấy hơn 50% số dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây Chùm ngây có khả năng kháng lại các loài vi khuẩn gây. - Hầu hết các dòng vi khuẩn nội sinh cho thấy khả năng kháng khuẩn được tuyển chọn để tiếp tục thực hiện thí nghiệm tiếp theo nhằm xác định cơ chế đối kháng thông qua khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ly tâm và tế bào sống vi khuẩn nội sinh.. - Trần Trọng Hiếu và Nguyễn Hữu Hiệp (2016) cũng tìm thấy dòng vi khuẩn nội sinh B. - megaterium phân lập từ cây Trinh nữ có khả năng kháng vi khuẩn A.. - Hình 4: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh đối với Aeromonas hydrophila 3.3 Tính kháng khuẩn của dịch ly tâm môi. - trường nuôi cấy vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn gây bệnh. - Trong thí nghiệm này, dòng T3.3 cho kết quả cả dịch tế bào vi khuẩn và dịch ly tâm của vi khuẩn đều thể hiện khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh S. - Dịch ly tâm của vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cải Exiguobacterium acetylicum có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn E. - 3.3.1 Tính kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn với vi khuẩn E. - Kết quả ghi nhận được hầu hết dịch tế bào của các dòng vi khuẩn có khả năng tạo vòng kháng với vi khuẩn E. - Nguyên nhân đường kính vòng kháng của các dòng này nhỏ hơn kết quả được ghi nhận ở thí nghiệm trước đó có thể giải thích do sau quá trình ly tâm và gạn rửa, vi khuẩn nội sinh đang ở pha tiềm phát dẫn đến khả năng kháng khuẩn chưa cao. - Ở ngày thứ 2 và thứ 3, vi khuẩn dần thích nghi và gia tăng mật số, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn, kết quả được chứng minh bởi đường kính vòng kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn tăng đều sau 3 ngày quan sát. - Beiranvand et al., (2017) cũng tìm thấy dòng vi khuẩn EB69 và EB7 được phân lập từ các cây dược liệu ở Iran có khả năng kháng rất tốt với tế bào vi khuẩn E. - Hình 5: Khả năng kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh E. - khuẩn với vi khuẩn S.aureus. - Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn nội sinh với S.aureus phân thành 3. - Nhóm các dòng vi khuẩn có khả năng tạo đường kính vòng kháng tăng dần sau 3 ngày gồm 6/9 dòng T3.3, T1.5, V4.1, C3.3, R1.4 và C1.4 (Hình 6).. - Hình 6: Khả năng kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh S. - Nhóm thứ 2 gồm các dòng vi khuẩn có khả năng cạnh tranh với S. - Beiranvand et al., (2017) cũng tìm thấy dòng vi khuẩn EB5 và EB7 phân lập từ các cây dược liệu ở Iran có khả năng kháng rất tốt với tế bào vi khuẩn S.. - 3.3.3 Tính kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn với vi khuẩn A. - Dịch tế bào vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng A. - Kết quả chứng minh các dòng vi khuẩn nội sinh này có khả năng sinh trưởng và kháng khuẩn tốt sau quá trình ly tâm và gạn rửa bằng nước muối sinh lý. - Các dòng vi khuẩn còn lại có hoạt tính kháng khuẩn thấp hơn, tuy nhiên, 0,0. - dòng vi khuẩn. - mặt vi khuẩn gây bệnh. - Theo Hammed et al., (2015) khi sử dụng nước trích lá cây chùm ngây có khả năng kháng vi khuẩn A. - Hình 7: Khả năng kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh A. - Nhìn chung, các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây chùm ngây có khả năng kháng khuẩn tốt. - Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn có nguồn gốc từ lá, thân, rễ, củ và vỏ củ của cây chùm ngây cho thấy số lượng các dòng vi khuẩn được phân lập từ củ nhiều nhất và là các dòng có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất. - Thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh nói chung và dịch tế bào sống nói riêng cho kết quả dòng C3.3, C1.6, C1.4 và C3.5 có hoạt tính kháng khuẩn cao với 3 loài vi khuẩn gây bệnh được sử dụng trong nghiên cứu. - Dòng C3.3 và C1.4 có khả năng kháng lại cả 3 loài vi khuẩn gây bệnh E.coli, S. - hydrophila, dòng T3.3 có khả năng tiết hợp chất kháng khuẩn trong quá trình nuôi cấy là các dòng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng cao được tuyển chọn để định danh nhằm phục vụ các nghiên cứu về sau.. - 3.4 Nhận diện dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng. - Hai dòng vi khuẩn C3.3 và C1.4 có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh tốt được nhận diện theo. - Theo kết quả nghiên cứu của đề tài, dòng C3.3 được nhận diện là loài Bacillus subtilis NBT-15 với độ tương đồng 98% có nguồn gốc phân lập từ củ của cây chùm ngây và cho thấy khả năng kháng lại cả 3 loài vi khuẩn gây bệnh E.coli, S. - Dòng C1.4 có khả năng kháng lại cả 3 loài vi khuẩn gây bệnh E.coli, S. - Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn này đã được chứng minh trong nghiên cứu của, Rowaida et al. - Bảng 2: Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn triển vọng. - Ba mươi lăm dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ lá, thân, rễ, củ và vỏ củ của cây Chùm ngây trồng tại huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp. - Trong số 35 dòng thì có 19/35 dòng có khả năng kháng ít nhất 1 loài vi khuẩn gây bệnh, cụ thể 9/35 dòng có khả năng kháng được vi khuẩn E. - hydrophila và 9/35 dòng có khả năng kháng vi khuẩn S. - Hai dòng C3.3 và C1.4 có khả năng kháng tốt với cả 3 loài vi khuẩn gây bệnh. - Dòng T3.3 được ghi nhận có dịch ngoại bào và dịch tế bào có khả năng tạo vòng kháng khuẩn với vi khuẩn S. - Khảo sát đặc tính kháng của những dòng vi khuẩn phân lập với những dòng vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh khác.. - Phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn nội sinh ở cây Trinh nữ (Mimosa pudica L