- PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN TRONG BÙN LẮNG CỦA BỂ CHỨA NƯỚC THẢI NHÀ MÁY LỌC HÓA DẦU CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỖN HỢP BENZENE, TOLUENE VÀ XYLENE. - Benzene, phân hủy sinh học, toluene, vi khuẩn, xylene Keywords:. - Khi lưu tồn trong đất và nước, BTX gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy hỗn hợp BTX. - Từ 5 mẫu bùn lắng được thu tại bể chứa nước thải của nhà máy lọc hóa dầu, 21 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển tạo sinh khối trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung BTX như nguồn carbon duy nhất đã được phân lập. - Kết quả cho thấy 2 dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22 có khả năng tạo sinh khối cao hơn các dòng vi khuẩn còn lại trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung 0,01. - 0,5 và 1% (v/v) từng hydrocarbon khảo sát, trong đó dòng BTX-S21 có khả năng phân huỷ hoàn toàn benzene và toluene. - phân hủy hơn 92% xylene với nồng độ từng hydrocarbon là 0,01. - 0,1 và 0,25% (v/v) sau 24 giờ nuôi cấy.. - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn trong bùn lắng của bể chứa nước thải nhà máy lọc hóa dầu có khả năng phân hủy hỗn hợp benzene, toluene và xylene.. - Trong quá trình sản xuất, tinh lọc xăng dầu và trong công nghiệp, nước thải có chứa BTX nếu không được xử lý sẽ gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. - Sự ô nhiễm BTX trong nước thải từ nhà máy lọc và sản xuất dầu cũng như trong công nghiệp hóa chất là mối quan tâm lớn vì khả năng phát tán và độc tính của chúng (Paixão et al., 2007;. - Phương pháp sinh học thông qua việc sử dụng vi sinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả độc chất có thể được ứng dụng để xử lý môi trường đất và nước bị nhiễm BTX (Jean et al., 2002. - Những nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy BTX trước đây cho thấy vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa M, Pseudomonas aeruginosa MN và Bacillus subtilis DM-04 được phân lập từ đất ô nhiễm xăng, dầu có khả năng phân hủy hỗn hợp BTX (Das and Mukherjee, 2007). - (2010) đã chứng minh vi khuẩn Pseudomonas putida CCMI852 được phân lập từ bể xử lý nước thải có khả năng phân hủy đồng thời xylene và toluene. - Ngoài ra, theo Nguyễn Thị Phi Oanh và Nguyễn Vũ Bích Triệu (2017), dòng vi khuẩn Rhodococcus sp. - XL6.2 được phân lập từ hệ thống xử lý nước thải có khả năng phân hủy xylene cao. - Cho đến nay, những nghiên cứu về sự phân hủy sinh học hydrocarbon thơm ở Việt Nam nói chung và ở Đồng bằng sông Cửu Long chỉ tập trung vào vi khuẩn phân hủy từng hợp chất riêng lẻ, chưa có nghiên cứu về sự phân hủy sinh học hỗn hợp hydrocarbon thơm được công bố. - Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy hỗn hợp BTX làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo về xử lý sinh học hỗn hợp hydrocarbon thơm trong nước thải từ các nhà máy lọc và sản xuất dầu ở Đồng bằng sông Cửu Long.. - 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phân lập vi khuẩn từ bùn lắng có khả năng phân hủy hỗn hợp BTX. - vi khuẩn có khả năng phân hủy hỗn hợp BTX. - Phương pháp phân lập vi khuẩn được thực hiện như sau: Cho 5 g mẫu bùn lắng vào bình tam giác chứa 50 mL môi trường khoáng tối thiểu (MM) gồm 1,4196 g Na 2 HPO 4 . - pH=70,2 và bổ sung 1% (v/v) từng loại hydrocarbon (BTX). - Sau một tuần, chuyển 1 mL mẫu sang môi trường MM mới có bổ sung 1% (v/v) từng loại hydrocarbon và tiếp tục nuôi cấy cùng một điều kiện thí nghiệm như đợt 1 trong một tuần. - Sau đó, mẫu được để yên 30 phút, hút phần dịch lỏng và pha loãng với môi trường MM đến 10 -5 (hệ số pha loãng 10). - Một trăm µL dịch vi khuẩn của từng độ pha loãng được trải lên môi trường MM đặc có bổ sung 1% (v/v) từng loại hydrocarbon, mẫu được ủ ở 32ºC.. - Sau một tuần, chọn những khuẩn lạc rời rạc, khác nhau về hình thái để phân lập thuần bằng phương pháp cấy ria trên môi trường Trypticase soy agar (30 g/L trypticase soy broth, 15 g/L agar). - Vi khuẩn sau khi phân lập thuần sẽ được ghi nhận đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường TSA (Nguyễn Thị Phi Oanh và Nguyễn Vũ Bích Triệu, 2017).. - 2.2 Khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung hỗn hợp BTX ở các nồng độ khác nhau. - Chủng một khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA của mỗi dòng vi khuẩn phân lập được vào môi trường Trypticase soy broth (30 g/L) và lắc mẫu 200 vòng/phút trên máy lắc tròn trong 12 giờ. - Chủng 10 µL dịch vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ quang vào ống nghiệm chứa 4 mL môi trường MM lỏng có bổ sung cả 3 loại hydrocarbon với nồng độ của từng loại hydrocarbon lần lượt là 0. - Mỗi dòng vi khuẩn tương ứng với mỗi nồng độ của từng hydrocarbon khảo sát được xem là một nghiệm thức thí nghiệm và được lặp lại 3 lần tương ứng với 3 ống nghiệm. - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không bổ sung BTX. - cao) khi có bổ sung BTX và không tạo sinh khối khi không bổ sung BTX sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo (Nguyễn Thị Phi Oanh và Nguyễn Vũ Bích Triệu, 2017).. - 2.3 Thiết lập đường chuẩn về mối tương quan giữa mật số vi khuẩn và giá trị mật độ quang (OD 600nm. - Chủng một khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA của mỗi dòng vi khuẩn (được tuyển chọn từ kết quả ở Mục 2.2) vào môi trường TSB.. - Pha loãng huyền phù của mỗi dòng vi khuẩn thành các độ pha loãng và 1/16 của mẫu gốc. - Sau đó, mật độ quang của các huyền phù vi khuẩn đã pha loãng được đo ở bước sóng 600 nm, đồng thời mật số vi khuẩn ở từng độ pha loãng được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt.. - 2.4 Khảo sát khả năng phân hủy hỗn hợp BTX của vi khuẩn trong môi trường MM lỏng. - Chủng 10 µL vi khuẩn vào 4 mL môi trường MM lỏng có bổ sung BTX (dựa vào kết quả thí nghiệm ở Mục 2.2 để chọn nồng độ hydrocarbon thích hợp bổ sung vào thí nghiệm). - Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn. - Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành xác định độ đục của môi trường nuôi cấy (OD 600nm ) đồng thời định lượng mỗi hydrocarbon còn lại trong môi trường nuôi cấy bằng phương pháp sắc ký khí GC-FID (Nguyễn Thị Phi Oanh và Nguyễn Vũ Bích Triệu, 2017).. - Phương pháp xác định nồng độ BTX trong môi trường nuôi cấy lỏng được thực hiện như sau: Sau. - 3.1 Vi khuẩn có khả năng phân hủy hỗn hợp BTX. - Từ 5 mẫu bùn lắng được thu tại bể nước thải của nhà máy lọc hóa dầu ở Cần Thơ, 21 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường MM có bổ sung 1% (v/v) từng hợp chất khảo sát gồm BTX đã được phân lập. - Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập có hình tròn, bìa nguyên, màu cam, trắng sữa hoặc trắng ngà, bề mặt trơn hoặc nhăn. - Tế bào của tất cả các dòng vi khuẩn đều có hình que. - Hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đại diện được trình bày ở Hình 1.. - Hình 1: Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy BTX. - 3.2 Sự tăng trưởng của vi khuẩn trong môi trường MM có bổ sung hỗn hợp BTX ở các nồng độ khác nhau. - Trong 21 dòng vi khuẩn phân lập, 2 dòng BTX-S21 và BTX-S22 có khả năng sinh trưởng và tạo sinh khối trong môi trường MM có bổ sung hỗn hợp BTX ở tất cả các nồng độ khảo sát và khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (không bổ sung BTX) sau 5 ngày nuôi cấy. - Cả 2 dòng vi khuẩn này đều phát triển và tạo sinh khối cao nhất ở nồng độ từng loại BTX từ v/v). - Sự khác biệt về sinh khối của vi khuẩn trong môi trường có bổ sung hỗn hợp BTX so với nghiệm thức đối chứng có chủng vi khuẩn và không bổ sung hỗn hợp BTX được thể hiện ở Hình 2.. - Vì vậy, nồng độ 0,01. - 0,1 và 0,25 % (v/v) của từng hydrocarbon được bổ sung để khảo sát sự phân huỷ hỗn hợp BTX của 2 dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22. - Về đặc điểm khuẩn lạc và tế bào, cả hai dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, lài, tế bào có hình que. - Dòng vi khuẩn. - Dòng vi khuẩn BTX-S22 có khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt nhăn, kích thước 3 mm, tế bào có kích thước 3,5 x 1 µm. - Hình thái khuẩn lạc của 2 dòng vi khuẩn trên môi trường TSA sau 3 ngày nuôi cấy được trình bày ở Hình 3.. - Hình 2: Sự khác nhau về độ đục của dòng vi khuẩn BTX-S21 trong môi trường MM lỏng ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung BTX (A). - và có bổ sung BTX (B). - Hình 3: Hình thái khuẩn lạc của 2 dòng vi khuẩn BTX-S21 (A) và BTX-S22 (B) có khả năng sinh trưởng tạo sinh khối cao trong môi trường MM có bổ sung BTX ở các nồng độ khác nhau 3.3 Đường chuẩn về mối tương quan giữa. - mật số vi khuẩn và giá trị mật độ quang (OD 600nm. - Từ kết quả đếm sống và giá trị OD 600nm đo được, đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa mật số vi khuẩn và giá trị OD 600nm được thiết lập (Hình 4). - Theo đó, phương trình hồi quy của 2 dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22 lần lượt là y = 137,46x - 8,9228 và y = 137,83x - 10,842. - phương trình hồi quy đều có độ tin cậy trên 95%, nên mật số đếm sống của 2 dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22 ở OD 600nm = 0,7 lần lượt là 87,301,47x10 8 và 85,643,74x10 8 CFU/mL. - Như vậy, khi chủng 10 µL huyền phù từng dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22 vào 4 mL môi trường MM lỏng thì mật số vi khuẩn tương đương 2 x 10 7 CFU/mL.. - 3.4 Khả năng phân hủy hỗn hợp BTX của vi khuẩn. - Hai dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22 được nuôi cấy trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung hỗn hợp BTX với nồng độ từng hợp chất là 0,01. - Sau 24 giờ nuôi cấy, cả 2 dòng vi khuẩn đều tạo sinh khối khác biệt có ý nghĩa thống kê (độ tin cậy 95%) so với nghiệm thức đối chứng. - Điều này chứng tỏ cả 2 dòng vi khuẩn đều có khả năng sử dụng BTX để tăng trưởng, trong đó, dòng vi khuẩn BTX-S21 tạo sinh khối cao nhất ở 3 trong 4 nồng độ BTX khảo sát (Hình 5).. - Hình 5: Mối liên hệ giữa hàm lượng BTX còn lại và mật độ quang của vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường MM có bổ sung BTX ở các nồng độ khác nhau. - A: nồng độ 0,01%. - B: nồng độ 0,05%. - C: nồng độ 0,1%. - D: nồng độ 0,25%. - Sự khác biệt về phần trăm phân hủy và mật độ quang ở độ tin cậy 95% của từng dòng vi khuẩn lần lượt được thể hiện bằng các kí tự viết hoa (A, B, C) và kí tự viết thường (a, b, c). - Trong đó, dòng vi khuẩn BTX-S21 có khả năng phân hủy hoàn toàn benzene, toluene ở cả 4 nồng độ khảo sát, xylene được phân hủy 95,42%. - 92,87% và 94,14% lần lượt ở nồng độ 0,01. - (v/v) BTX sau 24 giờ nuôi cấy. - Dòng vi khuẩn BTX- S22 có khả năng phân hủy hơn 90% toluene ở cả 4 nồng độ khảo sát sau 24 giờ nuôi cấy, trong khi dòng này chỉ phân hủy được trung bình 35,04% benzene và 58,57% xylene trong cùng một điều kiện nuôi cấy. - Cụ thể, dòng vi khuẩn BTX-S22 phân hủy được và 91,68% toluene lần lượt ở 4 nồng độ khảo sát sau 24 giờ nuôi cấy. - Như vậy, dòng vi khuẩn BTX-S22 phân hủy hiệu quả toluene, trong khi dòng vi khuẩn BTX-S21 phân hủy hỗn hợp BTX hiệu quả nhất (Hình 5).. - Dòng vi khuẩn Pseudomonas putida F1 phân huỷ 100%. - Dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri OX1 phân huỷ 100% benzene và toluene, 90% xylene sau 24 giờ nuôi cấy ở nồng độ v/v) (Nagarajan and Loh, 2015). - (2017) cũng chứng minh dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. - BTEX-30 có khả năng phân huỷ 99% benzene, 99% toluene, 86% ethylbenzene và 82% xylene với nồng độ 0,125% (v/v) sau 45 giờ nuôi cấy. - Trong nghiên cứu này, dòng vi khuẩn BTX-S21 có khả năng phân hủy hoàn toàn benzene và toluene, phân hủy xylene từ 92,87% đến 97,78%. - sau 24 giờ nuôi cấy ở các nồng độ của từng hydrocarbon thơm trong hỗn hợp khảo sát là 0,01;. - Như vậy, dòng vi khuẩn BTX-S21 có khả năng phân huỷ BTX hiệu quả hơn với thời gian nhanh hơn và phân hủy được nhiều nồng độ BTX hơn so với các nghiên cứu trước đây.. - Do đó, dòng vi khuẩn BTX-S21 là dòng vi khuẩn bản địa tiềm năng sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo để tìm ra giải pháp làm sạch BTX trong nước thải theo phương pháp sinh học.. - Từ 5 mẫu bùn lắng được thu trong bể chứa nước thải của nhà máy lọc hóa dầu, 21 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung 1% từng hydrocarbon khảo sát đã được phân lập, trong đó 2 dòng vi khuẩn BTX-S21 và BTX-S22 có khả năng tạo sinh khối nhanh khi môi trường được bổ sung BTX ở các nồng độ khác nhau sau 5 ngày nuôi cấy. - Sau 24 giờ nuôi cấy, cả 2 dòng vi khuẩn này đều thể hiện khả năng phân huỷ BTX cao, trong đó dòng vi khuẩn BTX-S21 có khả năng phân huỷ hiệu quả BTX ở các nồng độ khảo sát (100% benzene, 100% toluene và xylene được phân hủy từ 92,87% đến 97,78%).. - Phân lập vi khuẩn phân hủy xylene từ hệ thống xử lý nước thải