- PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY HOẠI TỬ GAN TỤY CỦA VI KHUẨN Vibrio paraheamolyticus PHÂN LẬP TỪ TÔM NUÔI Ở BẠC LIÊU Nguyễn Trọng Nghĩa 1 , Đặng Thị Hoàng Oanh 1 , Trương Quốc Phú 1 và Phạm Anh Tuấn 2. - Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính, Vibrio. - Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) đang được xem là bệnh nguy hiểm trên tôm nuôi. - Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập, định danh và xác định khả năng gây hoại tử gan tụy của chủng vi khuẩn được phân lập từ tôm thu ở những ao nuôi tôm thâm canh tại tỉnh Bạc Liêu có dấu hiệu lâm sàng của bệnh hoại tử gan tụy như gan tụy teo dai, ruột rỗng kèm theo một số biến đổi mô bệnh học trên vùng gan tụy như sự thoái hóa cấp tính của các tế bào gan, sự tập trung của tế bào máu cùng với nhiễm khuẩn thứ cấp. - Các chủng vi khuẩn phân lập được đều là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, có thể di động, dương tính với các chỉ tiêu oxidase và catalase, lên men đường trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí, có khả năng phát triển trên môi trường thiosulfate citrate bile salt với khuẩn lạc màu xanh, tròn, lồi và đường kính 2-3 mm. - Các chủng vi khuẩn được định danh là Vibrio parahaemolyticus (99,9% ID) bằng kit API 20E (BioMerieux). - Kết quả gây cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) khỏe với bốn nghiệm thức (tiêm 1,5% NaCl, 10 4 CFU/g, 10 5 CFU/g, 10 6 CFU/g) cho thấy vi khuẩn này có khả năng gây hoại tử gan tụy ở nghiệm thức tiêm 10 5 CFU/g (sau 9 ngày) và 10 6 CFU/g (sau 6 ngày) với dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học giống như tôm bệnh thu từ tự nhiên.. - Lightner et al., 2012. - Đặc biệt với sự xuất hiện của hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute hepatopancreatic nerosis syndrome - AHPNS) hay còn gọi là Hội chứng chết sớm (Early mortality syndrome) từ đầu năm 2011 đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm trong toàn vùng.. - Theo Lighner et al. - (2012), tôm bệnh thường có một số đặc điểm mô bệnh học đặc trưng như: (i) thoái hoá cấp tính của các ống gan tụy với sự rối loạn về chức năng của tế bào E, R và F. - (ii) nhân tế bào trương to, tế bào bị hoại tử rơi vào trong lòng ống gan tụy. - Ở giai đoạn cuối, phát hiện có hiện tượng tập trung của các tế bào máu và sự phát triển của tác nhân vi khuẩn thứ cấp chủ yếu là nhóm vi khuẩn Vibrio trong vùng gan tụy, đặc biệt là ở những ống gan tụy bị hoại tử và thoái hoá (Flegel, 2012). - Tác nhân gây nên AHPNS được xác định là do chủng vi khuẩn Vibrio parahemolyticus duy nhất được phân lập từ dạ dày tôm bệnh hoại tử gan tụy cấp thu tại ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh và khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn này được xác định bằng phương pháp ngâm (Loc et al., 2013).. - Tuy nhiên, vi khuẩn V. - parahaemolyticus đã được phân lập với tần số cao từ gan tụy của tôm bệnh hoại tử gan tụy tại một số tỉnh ĐBSCL (Quảng. - Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập và xác định khả năng gây hoại tử gan tụy cấp tính bằng phương pháp tiêm vi khuẩn V. - parahaemolyticus phân lập từ gan tụy tôm AHPNS thu tại xã Vĩnh Hậu, huyện Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu.. - 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu và phân lập vi khuẩn từ mẫu tôm bệnh. - Mẫu tôm bệnh còn sống được thu tại 3 ao nuôi thuộc xã Vĩnh Hậu, huyện Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu. - Trước khi phân lập vi khuẩn, bề mặt ngoài của tôm được khử trùng bằng cồn 70 và lau sạch.. - Dùng pen tách bỏ phần giáp đầu ngực, khử trùng bề mặt gan tụy tôm rồi dùng nhíp tiệt trùng lấy một ít gan tụy tôm phết đều lên lame sạch có sẵn một giọt dung dịch Davidsion (không có glacial acetic acid), để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó cố định trong dung dịch 1% acetic acid, rồi nhuộm Gram.. - Kế đến, dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít mẫu gan tụy cấy lên đĩa nutrient agar (NA, Merck) và môi trường thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS, Merck). - Các chủng vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong môi trường nutrient broth (NB, Merck) (có bổ sung 1.5%. - 2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa được chọn để định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được trình bày trong Bảng 1.. - Hình dạng kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow and Feltham, 1993). - Tính di động của vi khuẩn được quan sát bằng cách nhỏ một giọt nước cất lên lame, trải đều lên lame một ít vi khuẩn, đậy bằng lamella và quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 40X. - 2.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm Chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm được nuôi tăng sinh trong môi trường NB (có bổ sung 1.5% NaCl) trong 24 giờ ở 28C. - Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch (CFU/ml). - Sau đó pha loãng vi khuẩn. - 2.4 Gây cảm nhiễm. - Tôm có màu sắc sáng, phản ứng nhanh, không có tổn thương bên ngoài, gan tụy khỏe, ruột đầy. - (2) tiêm vi khuẩn nồng độ 10 4 CFU/con. - (3) tiêm vi khuẩn nồng độ 10 5 CFU/con;. - (4) tiêm vi khuẩn nồng độ 10 6 CFU/con. - Mỗi con tôm được tiêm 50µl dung dịch vi khuẩn ở đốt bụng thứ 3. - 3.1 Dấu hiệu bệnh lý của tôm thu từ ao nuôi Tôm bệnh hoạt động chậm chạp, bỏ ăn, lờ đờ và tắp mé. - Khi tách bỏ lớp vỏ đầu ngực, quan sát thấy gan tụy teo, dai, nhạt màu, ruột rỗng (Hình 1).. - Hình 1: Tôm có dấu hiệu gan tụy teo, dai (A) và ruột rỗng (B) Các dấu hiệu ghi nhận được tương tự trong mô. - tả của Lightner et al. - (2012) về các dấu hiệu bệnh lý của tôm khi mắc phải hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính. - Lightner (2012) cho biết tôm bệnh hoại tử gan tụy trong ao nuôi thường có một số các dấu hiệu như tôm chết đáy, bỏ ăn, gan tụy teo, dai, nhạt màu, ruột rỗng và có hiện tượng mềm vỏ. - Khi quan sát các mẫu phết kính gan tụy nhuộm Gram của những mẫu tôm bệnh, phát hiện nhiều vi khuẩn gram âm, hình que trên vùng mô phết kính (Hình 2). - Quan sát tiêu bản kính phết gan tụy tôm bệnh cho thấy có sự biến đổi cấu trúc của mô gan tụy, số lượng các không bào rất ít, các tế bào gan thoái hóa và rơi vào lòng ống, xuất hiện hiện tượng melamin hóa ở vùng gan hoại tử và xuất hiện của các tế bào máu quanh các cụm vi khuẩn trong vùng bị hoại tử (Hình 3).. - Hình 2: Kính phết gan tụy tôm khỏe (A) và tôm bệnh với các cụm vi khuẩn gram âm hình que ngắn (B) (100X). - Các đặc điểm mô bệnh học được ghi nhận tương tự như mô tả chi tiết trong định nghĩa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của Lightner et al. - (2012) khi phân tích mô bệnh học và siêu cấu trúc của tôm hoại tử gan tụy ở khu vực ĐBSCL thấy tôm bệnh có dạng hoại tử tương ứng với dấu hiệu gan tụy teo, dai và sậm màu. - hội chứng hoại tử gan tụy là tình trạng thoái hóa cấp tính của gan tụy kèm theo sự giảm hoạt động của tế bào E, rối loạn chức năng của các tế bào B, F và R, dễ thấy những tế bào có nhân trương to, các tế bào bị bong tróc và rơi vào lòng ống gan tụy và giai đoạn cuối là sự tập trung của các tế bào máu ở giữa ống gan tụy và nhiễm khuẩn thứ cấp kèm theo hiện tượng melanin hóa (Flegel, 2012).. - Hình 3: Gan tụy tôm bệnh có sự biến đổi cấu trúc của mô gan tụy (A) (10X). - Các tế bào gan thoái hóa và rơi vào lòng ống, các tế bào máu tập trung quanh các cụm vi khuẩn trong vùng bị hoại tử (B) (40X). - 3.2 Phân lập vi khuẩn và định danh vi khuẩn Ba chủng vi khuẩn phân lập được từ gan tụy tôm bệnh của 3 thu mẫu được đặt tên là BL1, BL2 và BL3. - Kết quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn được phân lập từ tôm bệnh được trình bày ở Bảng 1. - Các chủng vi khuẩn phát triển trên môi trường TCBS có khuẩn lạc màu xanh, tròn, lổi, đường kính 2-3 mm (Hình 4). - Hình 4: (A) Khuẩn lạc trên môi trường TCBS. - Hình 5: A.Vi khuẩn gram âm, hình que ngắn (100X). - Vi khuẩn lên men glucose hiếu khí và kị khí Kết quả trên cho thấy cả 3 chủng vi khuẩn phân. - lập từ tôm bệnh thu được có những đặc tính chung của nhóm vi khuẩn Vibrio là gram âm, hình que ngắn, có thể di chuyển trong môi trường lỏng, cho phản ứng catalase và oxidase dương tính, có khả năng lên men glucose trong điều kiện kị khí và yếm khí, mọc trên môi trường TCBS (Buller, 2004). - Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và kết quả kiểm tra bằng kit API 20E các chủng vi khuẩn này được định danh là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. - Các đặc điểm tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên cứu định danh các chủng vi khuẩn phân lập được từ tôm bệnh hoại tử gan tụy thu ở một số tỉnh thuộc khu vực. - parahaemolyticus có khả năng phát triển tốt hơn so với các loài vi khuẩn khác trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and Larock, 1985). - vi khuẩn trong 24 mẫu nước thu tại cửa sông Coreaú, vùng Đông Bắc Brazil phát hiện có sự chiếm đa số của vi khuẩn này (Renata et al., 2010).. - Ngoài ra, còn phát hiện được trên gan tụy tôm sú bệnh thu ở Uran Maharashira, Ấn Độ với các dấu hiệu bệnh lý như chậm lớn, lờ đờ, cơ thể chuyển sang màu đỏ và chết (Abhay et al., 2003).. - Pitogo et al., 1998), Ấn Độ (Jayasree et al., 2006), liên quan đến một số bệnh như nhiễm khuẩn cục bộ, nhiễm khuẩn trên gan tụy trên tôm sú, hội chứng đỏ thân và mềm vỏ trên tôm (Lightner, 1996). - Gần đây, vi khuẩn này được phát hiện với tần số xuất hiện cao khi phân lập trên gan tụy tôm hoại tử gan tụy cấp tính thu tại tỉnh Bạc Liêu, Trà Vinh, Cà Mau và Sóc Trăng (Quãng Trọng Phát, 2013. - Bảng 1: Đặc điếm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ tôm AHPNS. - Chỉ tiêu BL1 Chủng vi khuẩn BL2 BL3 ATCC 17802. - 3.3 Khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn V. - parahaemolyticus phân lập từ gan tụy tôm AHPNS. - Kết quả gây cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng (L. - khuẩn và nghiệm thức đối chứng (tiêm dung dịch 1.5% NaCl) cho thấy vi khuẩn này có khả năng gây hoại tử gan tụy ở nghiệm thức tiêm 10 5 CFU/con (sau 9 ngày) và 10 6 CFU/con (sau 6 ngày) (Bảng 2).. - Bảng 2: Mô học mẫu tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. - tiêm vi khuẩn. - Nghiệm thức Tiêm dung dịch. - Tiêm vi khuẩn (10 4 CFU/con). - Tiêm vi khuẩn (10 5 CFU/con). - Tiêm vi khuẩn (10 6 CFU/con). - không có dấu hiệu AHPNS. - một phần gan tụy có dấu hiệu APHNS. - B) Gan tụy tôm ở nghiệm thức đối chứng (A: 10X &. - (C) Gan tụy tôm tiêm V. - parahemolyticus sau 3 ngày có dấu hiệu teo ống gan tụy, số lượng tế bào B, F và R giảm nhiều (10X). - (D) Gan tụy tôm tiêm V. - parahemolyticus sau 6 ngày cấu trúc của mô gan tụy biến đổi, ống gan tụy không có tế bào B, F và R, các tế bào gan thoái hóa, rơi vào lòng ống (40X). - (F) Gan tụy tôm tiêm V. - parahemolyticus sau 9 ngày, các tế bào gan thoái hóa, xuất hiện hiện tượng melamin hóa và các tế bào máu tập trung quanh các cụm vi khuẩn. - trong vùng bị hoại tử (40X). - Tôm bệnh hoạt động chậm chạp, bỏ ăn, gan tụy teo, dai và nhợt nhạt, ruột rỗng. - Tôm ở nghiệm thức đối chứng (tiêm dung dịch 1.5% NaCl) thì gan tụy vẫn có cấu trúc bình thường qua các lần thu mẫu (Hình 6). - Nhóm tác giả cho rằng bệnh tích AHPND không thể được lây nhiễm bằng phương pháp tiêm cơ, vì khi gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm dịch chiết tôm bệnh AHPND không qua màng lọc vào cơ thịt tôm. - Sự khác biệt này có thể do hai chủng vi khuẩn được sử dụng gây cảm nhiễm là khác nhau nên mức độ xâm nhiễm và gây bệnh của chúng cũng khác nhau.. - Vi khuẩn phân lập từ gan tụy tôm AHPNS thu ở những ao nuôi tôm thâm canh tại tỉnh Bạc Liêu được định danh là Vibrio parahaemolyticus. - Vi khuẩn có khả năng gây hoại tử gan tụy cấp khi gây cảm nhiễm thực nghiệm trên tôm thẻ chân trắng ở nghiệm thức tiêm 10 5 CFU/g (sau 9 ngày) và 10 6 CFU/g (sau 6 ngày) với dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học giống như tôm bệnh thu từ tự nhiên.. - Các nội dung nghiên cứu trong báo cáo này được thực hiện từ nguồn kinh phí của “Nhiệm vụ xác định nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy trên tôm tại các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau và Bến Tre” năm 2012 do Tổng cục Thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cấp kinh phí.. - hoại tử gan tụy trong ao nuôi tôm thâm canh ở huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng.. - Một số kết quả chẩn đoán mô bệnh học và phân tích siêu cấu trúc của hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long.. - Định danh và xác định tính nhạy của thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phân lập từ tôm bệnh hoại tử gan tụy ở Sóc Trăng và Trà Vinh. - Phân lập và xác định tính nhạy đối với thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phân lập từ tôm bệnh hoại tử gan tụy ở Cà Mau