- PHÂN LẬP VI KHUẨN LIÊN KẾT VỚI HẢI MIÊN Ở HÒN NGHỆ, VÙNG BIỂN HÀ TIÊN, TỈNH KIÊN GIANG, VIỆT NAM. - Bacillus, hải miên, hòn Nghệ, kháng khuẩn, vi khuẩn liên kết với hải miên. - Đề tài được thực hiện nhằm phân lập được những dòng vi khuẩn liên kết với hải miên có khả năng tạo hoạt tính kháng khuẩn. - Từ 29 mẫu hải miên sưu tập tại Hòn Nghệ, thuộc vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang đã phân lập được 236 dòng vi khuẩn trên 2 môi trường MA (Marine Agar và SYP (Starch-Yesat extract-Peptone). - Qua kết quả khảo sát với 6 chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh cho người và động vật: Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans và Edwardsiella ictaluri, có 155/236 dòng vi khuẩn có khả năng tạo hoạt chất kháng khuẩn kháng lại ít nhất 1 trong 6 chủng vi sinh vật kiểm định. - Tuyển chọn được 13 dòng vi khuẩn (SN13d, SN14e, SN12m, SN20e, SN24d, MN26d, MN26g, N1a, N11d, N10a, N6a, N9a) có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, mỗi dòng kháng lại 3 nhóm vi khuẩn Gram âm, Gram dương và Candida albicans. - Nhận diện 12 dòng vi khuẩn này thuộc chi Bacillus và 1 dòng thuộc chi Halomonas. - Dòng Bacillus tequilensis N1a kháng mạnh với vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus và nấm men Candida albicans.. - Phân lập vi khuẩn liên kết với hải miên ở Hòn Nghệ, vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang, Việt Nam. - Trong những năm gần đây, tình trạng kháng kháng sinh đang ở mức báo động với sự xuất hiện của một số chủng vi sinh vật có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh. - Do đó vi sinh vật biển trở thành mục tiêu quan trọng đối với ngành công nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại kháng sinh mới, các hoạt chất sinh học có khả năng kháng khuẩn. - Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về các nhóm vi sinh vật liên kết với hải miên như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có khả năng sinh chất kháng khuẩn còn chưa nhiều.. - Rất nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn được tìm ra từ nhóm động vật này, đặc biệt là hải miên (ngành Porifera) đáng chú ý bởi tính đa dạng và cộng đồng vi sinh vật đa dạng trong mô của chúng. - Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2 - 3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước biển (Li et al., 2007). - Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên. - Hải miên được biết là nguồn giàu các sản phẩm sinh học tự nhiên có giá trị. - Rất nhiều sản phẩm sinh học có tác dụng kháng khuẩn của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết hải miên sinh ra (Newman, 2003).. - Việc nuôi cấy vi khuẩn liên kết hải miên có thể cung. - cấp hợp chất có khả năng kháng khuẩn với số lượng lớn và có thể ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học (Hoffmann, 2005).. - Ở Việt Nam, một số nghiên cứu về thành phần hải miên ở Vịnh Hạ Long, Nha Trang cho thấy thành phần của loài rất đa dạng, một số được công bố về tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ hải miên ở Việt Nam (Nguyen et al., 2013). - Những nghiên cứu về sự liên kết của các vi sinh vật trong hải miên chưa được chú ý nhiều. - Đến nay chỉ có một số công trình phân lập và xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất từ vi sinh vật biển của các nhà khoa học trong nước (Đỗ Đình Hạo và Phạm Thế Thư, 2010).. - Từ năm 2002 đến nay, nhóm hải miên bắt đầu được chú ý nghiên cứu ở các đề tài hợp tác quốc tế như:. - Các kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng loài hải miên ở vùng biển Việt Nam có khoảng 160 loài và phân bố tập trung ở vùng biển quanh các đảo ven bờ và xa bờ. - Một số kết quả nghiên cứu đã được công bố cho thấy tiềm năng của các loài hải miên thu tại Việt Nam.. - Chính vì vậy mục tiêu đề tài nhằm tìm kiếm các dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn liên kết với hải miên và có tiềm năng ứng dụng thực tế.. - Mẫu hải miên được thu tại Hòn Nghệ ở vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang (Hình 1), mẫu thu theo phương pháp SCUBA.. - *Các chủng vi sinh vật kiểm định:. - Các chủng vi khuẩn thử nghiệm trên đều là chủng vi sinh vật thế hệ F4 được mua từ công ty Microbiologics thông qua đại lý phân phối ở Việt Nam là công ty TNHH thiết bị khoa học Lan Oanh (Địa chỉ: 456 Phan Xích Long, Phường 2, Phú Nhuận, thành phố Hồ Chí Minh).. - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:. - Hóa chất để tinh sạch DNA của vi khuẩn. - Mẫu tiếp tục được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -4 0 C và tiến hành phân lập sau 1 tháng.. - 2.3.2 Phân lập vi khuẩn. - Mẫu hải miên được cắt nhỏ khoảng 1 cm 2 , và được rửa sạch nhiều lần bằng nước biển vô trùng trong tủ cấy vô trùng. - Ủ đĩa trong tủ ủ ở nhiệt độ 30 0 C từ 24 – 48 giờ để các vi khuẩn phát triển. - Chọn những khuẩn lạc có kích thước, hình dạng, màu sắc khác nhau cấy phân lập trên môi trường tương ứng.. - Chọn các khuẩn lạc khác nhau cấy vào các đĩa khác để phân lập và ủ ở 30 0 C;. - Cấy phân lập nhiều lần trên môi trường tương ứng cho tới khi quan sát thấy các khuẩn lạc tách rời nhau và đồng nhất;. - Chọn 1 khuẩn lạc tách rời cấy vào ống thạch nghiêng chứa môi trường tương ứng, ủ ở 30 0 C cho vi khuẩn phát triển;. - Kiểm tra dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để xác định độ ròng của vi khuẩn.. - Khi cấy vi khuẩn trên môi trường phân lập, tiến hành đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bằng mắt thường bao gồm các chỉ tiêu như sau:. - Khi khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trên môi trường phân lập đã ròng, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần bằng phương pháp giọt ép đồng thời ghi nhận hình thái tế bào với các tiêu chí sau: sự di động, vỏ nhày, nội bào tử. - dùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội, lấy vi khuẩn sợi trong ống nghiệm trải đều lên giọt nước trên lam kính và để khô tự nhiên. - hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn 2, 3 lần để cố định vi khuẩn sợi lên lam kính. - nhỏ 100 µL Crystal Violet lên trên vệt vi khuẩn sợi vừa cố định trong 1 phút. - tiếp tục nhỏ 100 µL Lugol lên trên vệt vi khuẩn sợi vừa cố định trong 1 phút;. - nhỏ 100 µL Safranin lên trên vệt vi khuẩn sợi vừa cố định trong 1 phút. - 2.3.5 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn. - Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (dựa theo phương pháp của Bauer, 1966): Theo Magaldi et al., (2004) và Valgas et al., (2007), mỗi dòng vi sinh vật kiểm định khác nhau cần những loại kháng sinh khác nhau, 3 loại kháng sinh được sử dụng là Streptomycin đối với dòng Bacillus cereus, Staphylococcus aureus chuyên ức chế vi khuẩn gram duơng (positive gram bacteria), Flucanozol, là thuốc đặc trị nấm đối với Candida albicans và Tetracyclin đối với các dòng vi sinh vật còn lại chuyên ức chế cho vi khuẩn cho xác định gram. - Tiêu chí đánh giá khả năng kháng khuẩn. - Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn thông qua sự hiện diện vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch.. - Quy ước khả năng kháng khuẩn:. - 2.3.6 Nhận diện vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử. - Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLAST N để nhận diện vi khuẩn ở mức độ đồng hình cao, vẽ cây phả hệ (phylogenetic tree) bằng phần mềm MEGA 7.0 đồng thời dựa vào các kết quả nhuộm Gram, kích thước, đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn…. - Từ 29 mẫu Hải miên thu được ở Hòn Nghệ đã phân lập được 236 dòng vi khuẩn, trong đó, 72 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường thạch MA và 164 dòng vi khuẩn trên môi trường thạch SYP.. - Trong 236 dòng vi khuẩn phân lập được trên 2 môi trường MA và SYP:. - Hình 2: Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn sau 48 giờ nuôi cấy. - A: Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn SN20l trên môi trường SYP B: Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn MN14b trên môi trường MA (Ngày chụp . - Sau khi phân lập 236 dòng vi khuẩn tiến hành kiểm tra khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyến tán qua giếng thạch (Bauer, 1966) với 6 chủng vi sinh vật kiểm định: Bacillus cereus (B), Escherichia coli (E), Salmonella typhimurium (S), Staphylococcus aureus (St), Candida albicans (C) và Edwardsiella ictaluri (Ed). - Quan sát đường kính vòng vô khuẩn tạo ra xung quanh giếng thạch thu được 155/236 dòng vi khuẩn kháng ít nhất 1 chủng vi sinh vật kiểm định.. - Dựa theo quy ước của Galindo (2004), tuyển chọn được 12/155 dòng vi khuẩn (SN13d, SN14e, SN12m, SN20e, SN24d, MN26d, MN26g, N1a, N11d, N10a, N6a, N9a) có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, mỗi dòng kháng lại 3 nhóm vi sinh vật bao. - gồm vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và Candida albicans trừ dòng N6a chỉ kháng mạnh trên vi khuẩn Bacillus cereus (Bảng 1).. - Theo tiêu chuẩn của Galindo (2004) các dòng MN26d, SN24d, N1a, N6a và N9a kháng trung bình với vi khuẩn Bacillus cereus và kháng sinh chuẩn Steptomycin. - dòng N10a kháng trung bình với vi khuẩn Staphylococcus aureus nhưng dòng vi khuẩn N1a kháng rất mạnh với vi khuẩn này và cả kháng sinh Streptomycin (Bảng 1). - Dòng vi khuẩn N1a lại kháng mạnh với nấm men Candida albicans và kháng sinh Flucanozol trong khi đó chỉ có dòng N11d kháng trung bình với nấm Candida albicans và kháng sinh Flucanozol (theo tiêu chuẩn của Galindo, 2004) (Bảng 1).. - Bảng 1: Kết quả khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được TT Dòng vi. - Khả năng kháng các dòng vi sinh vật kiểm định B. - Hình 3a: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn N1a thông qua vòng kháng khuẩn với vi khuẩn Staphyloccocus aureus, Bacillus cereus và kháng sinh Streptomycin. - Hình 3b: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn N10a với vi khuẩn Bacillus cereus và Staphylococcus aureus với kháng sinh Streptomycin. - Hình 3c: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn N11d với nấm men Candida albicans và kháng sinh Flucanozol ở mức trung bình. - Sau đây là danh sách 13 dòng vi khuẩn có độ kháng khuẩn cao có trình tự gen 16S đồng hình với. - Bảng 2: Danh sách 13 chủng vi khuẩn có độ đồng hình thông qua trình tự 16S với ngân hàng dữ liệu GenBank. - (2014) đã phân lập được 2.640 chủng vi khuẩn liên kết với 6 loài hải miên Cliona viridis, Callyspongia australis, Agelas dirpar, Haliclona oculata, Amphius huxleyi, Dycidea cinerea tại vùng biển Sơn Chà, tỉnh Thừa Thiên Huế, họ đã xác định được 3 hợp chất tự nhiên:. - megaterium LC phân lập trên hải miên Haliclona oculata có khả năng kháng Vibrio vulnificus và Vibrio parahaemolytics. - Với kết quả phân lập cho thấy thành phần vi khuẩn nội sinh với hải miên rất đa dạng. - Những nghiên cứu phát sinh loài trước đây đã nhận diện được 26 ngành vi khuẩn khác nhau liên kết hải miên biển, trong đó ngành Poribacteria hầu như chỉ tìm thấy trong hải miên. - Các loài hải miên khác nhau chứa quần thể vi khuẩn gồm các loài khác nhau, nhưng các loài này vẫn có quan hệ gần hơn so với các loài vi khuẩn ở môi trường nước xung quanh (Schmitt et al., 2012).. - Hình 4: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ của 13 dòng vi khuẩn liên kết với hải miên được phân lập ở vùng biển Hà Tiên (phân tích theo phương pháp Maximum-Likelihood) với bootstrap là 1000 Từ hải miên Haplosclerida simulans, Kennedy. - et al. - (2009) đã phân lập được 15 dòng vi khuẩn có khả năng kháng B. - trong đó đã phân lập được 2 chủng Bacillus licheniformis, và Bacillus pumilus được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn.. - cũng đã được phân lập trước đó từ 2 loài hải miên Halichondria panicea (Atikana et al., 2013) và Callyspongia diffusa (Dhasayan et al., 2015). - Pandey et al. - (2013) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus tequilensis từ 2 loài hải miên Aka coralliphaga, Sarcotragus fasciculatus. - Bacillus tequilensis có khả năng sinh subtilosin A, một loại kháng sinh mới với hoạt tính kháng một số vi khuẩn Gram dương, Bacillus tequilensis thể hiện hoạt tính kháng tốt đối với Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Candida albicans (Rani et al., 2016).. - (2006) phân lập và xác định được 6 chủng có khả năng kháng Escherichia coli là Bacillus sp. - Năm 2017, ở Indonesia, Yatnita đã phân lập được 4 dòng vi khuẩn liên kết với hải miên Xestospongia testudinaria có khả năng kháng Escherichia coli (đường kính vòng vô khuẩn từ 18- 23 mm).. - Kết quả của chúng tôi cho thấy các dòng vi khuẩn kháng mạnh vi khuẩn Gram dương như Bacillus cereus và Staphylococcus aureus cùng với. - kháng sinh Streptomycin đồng thời có dòng vi khuẩn kháng trung bình với nấm men Candada albicans cùng với kháng sinh Flucanozol trong khi có ít có dòng vi khuẩn kháng với các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli hay Salmonella typhimurium hoặc với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.. - Mười hai dòng vi khuẩn này được nhận diện thuộc chi Bacillus trong đó nhiều loài như Bacillus tequilensis và B. - Như vậy đa số các dòng vi khuẩn liên kết với hải miên là dòng vi khuẩn Bacillus có nội bào tử, trừ dòng Halomonas sp., có thể sống trong môi trường nước biển, kỵ khí.. - Từ 29 mẫu hải miên thu tại hòn Nghệ đã phân lập được 236 dòng vi khuẩn, trong đó có 72 dòng phân lập trên môi trường MA, 164 dòng phân lập trên môi trường SYP. - 155/236 dòng vi khuẩn có khả năng tạo hoạt chất kháng khuẩn kháng lại ít nhất 1 chủng vi sinh vật kiểm định. - Có 13/155 dòng có khả năng kháng nhiều dòng vi sinh vật kiểm định. - Kết quả định danh 13/155 dòng vi khuẩn được xác định thuộc 2 chi chính là chi Bacillus (12/13 dòng) và chi Halomonas (1/13 dòng).. - Xác định thành phần và công thức hóa học của các hợp chất kháng khuẩn từ các dòng vi khuẩn phân lập được nhất là dòng Bacillus tequilensis N1a đồng thời trích các chất này từ dung môi hữu cơ phù. - Một số nghiên cứu về vi sinh vật tại vùng ven biển Hải Phòng. - Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn liên kết 6 loài hải miên vùng biển Sơn Chà. - Hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng vi khuẩn phân lập từ bọt biển ở vùng đảo Phú Quốc, Việt Nam. - et al 2012.. - et al., 2007