- CHO QUÁ TRÌNH THANH TRÙNG NHIỆT. - Khi xử lý nhiệt, BAA ở nồng độ thấp bị vô hoạt. - Phương trình nhiệt động học đẳng nhiệt của BAA ở nồng độ 0.04mg/mL trong dung dịch đệm Tris/HCl, pH 8.6, CaCl 2 5 mM được mô tả bằng phương trình phản ứng bậc nhất. - Các thông số nhiệt động học của BAA ước lượng dưới chế độ xử lý đẳng nhiệt được kiểm chứng đúng dưới chế độ xử lý bất đẳng nhiệt. - Để đánh giá tốt hơn ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt lên sản phẩm, cần nghiên cứu kết hợp thêm một hệ thống chỉ thị tương tự với giá trị z khác.. - Sự phát triển của kỹ thuật quá trình nhiệt cùng với yêu cầu ngày càng phát triển của xã hội đối với chất lượng và an toàn thực phẩm đòi hỏi sự có mặt của kỹ thuật. - đánh giá hiệu quả những tác động của quá trình xử lý nhiệt đến thực phẩm. - Chỉ thị tương quan nhiệt độ và thời gian bằng phương pháp tích phân (TTI) được biết đến như là một phương pháp thích hợp để đánh giá tác động của quá trình xử lý nhiệt.. - TTI mô phỏng hoàn toàn hoặc gần như hoàn toàn ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt lên sản phẩm thực phẩm. - TTI dựa trên hoạt tính của enzyme cho thấy những ưu điểm so với các loại TTI khác dùng để đánh giá tác động của quá trình xử lý nhiệt lên sản phẩm. - Mục tiêu của nghiên cứu là nhằm phát triển một hệ thống chỉ thị sinh học cho quá trình thanh trùng nhiệt dựa vào hoạt tính của enzyme (trong khoảng nhiệt độ 60-100 o C).. - BAA đã và đang được nghiên cứu để phát triển TTI ứng dụng trong quá trình thanh trùng và tiệt trùng (Van Loey et al., 1997). - Do đó trong nghiên cứu này, BAA được chọn làm đối tượng nghiên cứu để phát triển TTI trong quá trình thanh trùng nhiệt.. - Ban đầu, BAA được pha trong dung dịch đệm 0.1 M Tris/HCl, pH 7.6 với nồng độ dung dịch mẫu gốc nồng độ 100 mg/ml và được lưu trữ ở nhiệt độ -80 o C trong nhiều ống nghiệm. - Tác chất dừng phản ứng trong phương pháp đo hoạt độ enzyme là dung dịch tri-sodium phosphate solution 20% (w/v), pH 11. - Dung dịch enzyme α-amylase được pha loãng trong dung dịch đệm citrate 0.1M, pH 6.0 (tại pH tối ưu enzyme bền nhiệt α-glucosidase). - Ảnh hưởng của ion Ca 2+ đến độ bền nhiệt của BAA cũng được nghiên cứu.. - Bảng 1: Các dung dịch enzyme trong thí nghiệm độ bền nhiệt của BAA. - Dung dịch đệm pH Nồng độ BAA (mg/ml). - Nhiệt độ T o C. - Xử lý đẳng nhiệt. - BAA được pha loãng từ dung dịch BAA gốc (100 mg/ml BAA trong dung dịch đệm 0.1 M Tris/HCl, pH 7.6) trong các dung môi thích hợp như bảng 1. - Xử lý đẳng nhiệt được thực hiện trong các bể điều nhiệt ở nhiệt độ thí nghiệm trong khoảng thời gian nhất định. - Xử lý không đẳng nhiệt. - Các ống thủy tinh kín có đường kính 1.2 cm chứa 1 mL dung dịch BAA được xử lý nhiệt trong các bể điều nhiệt. - Nhiệt độ của dung dịch được đo bằng cặp nhiệt điện tại vị trí 2 cm cách đáy ống nghiệm. - Đồ thị mô tả tương quan thời gian – nhiệt độ được ghi nhận với bước thời gian 2 giây suốt quá trình nâng nhiệt cho đến khi làm lạnh.. - Tương quan thời gian – nhiệt độ trong quá trình phản ứng ức chế nhiệt enzyme và sự phụ thuộc của hằng số phản ứng vào nhiệt độ được mô tả bằng các phương trình khác nhau. - Sự phụ thuộc theo nhiệt độ của hằng số tốc độ vô hoạt enzyme trong quá trình xử lý nhiệt được được mô tả theo phương trình Arrhenius:. - Phân tích không hồi qui một bước bằng phần mềm phân tích SAS (phiên bản 9.1, Cary, USA) để thiết lập các phương trình mô tả mối tương quan nhiệt độ - thời gian cũng như ước lượng các thông số động nhiệt học của quá trình vô hoạt của enzyme. - Trong đó, ảnh hưởng của nhiệt độ lên hằng số vô hoạt enzyme cũng được tính đến. - Kết hợp hoạt tính của enzyme sau khi xử lý nhiệt và tương quan nhiệt độ thời gian ghi nhận bằng cặp nhiệt điện để ước lượng các thông số nhiệt động học của quá trình vô hoạt enzyme ở chế độ xử lý bất đẳng nhiệt. - Trong trường hợp sự vô hoạt BAA tuân theo phương trình bậc nhất, các phương trình sau biểu diễn sự vô hoạt của BAA:. - Xác định khoảng làm việc cho phép của phương pháp xác định hoạt độ BAA Khoảng làm việc cho phép của phương pháp đo hoạt độ BAA được thực hiện trong dung dịch đệm citrate pH 6.0, pH tối ưu cho hoạt động của BAA (Lee et al., 2006) và cho hoạt động của enzyme bền nhiệt α-glucosidase nằm trong bộ cơ chất Ceralpha. - Độ bền nhiệt của BAA 0.4mg/mL trong dung dịch đệm 0.1M Tris/HCl, pH 8.6 Để có thể sử dụng BAA như một TTI trong quá trình thanh trùng nhiệt, BAA phải có khả năng bị vô hoạt không đảo ngược trong khoảng nhiệt độ thành trùng đang nghiên cứu. - Vì vậy độ bền nhiệt của BAA (nồng độ 0.4 mg/mL trong dung dịch đệm 0.1M Tris/HCl, pH 8.6) được kiểm tra trong khoảng nhiệt độ từ 40 o C đến 120 o C.. - Hoạt độ BAA sau xử lý. - Hình 1 cho thấy BAA khá bền nhiệt trong khoảng nhiệt độ thí nghiệm. - Hoạt độ của BAA giảm không đảo ngược khi nhiệt độ tăng. - Hoạt độ của BAA giảm mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ 60 o C đến 100 o C. - Khi thanh trùng dung dịch BAA ở 120 o C trong 10 phút, enzyme BAA hoàn toàn bị vô hoạt. - Tuy nhiên, BAA bị vô hoạt theo hai bước khác nhau ở hai giai đoạn nhiệt độ khác nhau. - Đặc tính vô hoạt không đảo ngược của BAA theo nhiệt độ cũng được nhận thấy giống như trong nghiên cứu của Tomazic et al. - Trong nghiên cứu của Tomazic, sử dụng phương pháp so màu để đo hoạt độ của BAA, BAA bị vô hoạt không đảo ngược tại nhiệt độ 70 o C (pH 5.0) và 90 o C (pH 8.0).. - (2006) BAA cũng bị vô hoạt không đảo ngược trong khoảng nhiệt độ 30 đến 90 o C. - Thông thường, sự vô hoạt do nhiệt của enzyme BAA thường xảy ra kèm theo sự kết tụ enzyme, tùy theo nồng độ của enzyme và pH của dung môi hoặc dung dịch đệm (Tomazic và Klibanov, 1988;. - Các tác giả trên cho rằng quá trình kết tụ enzyme xảy ra nhiều nhất ở trạng thái cấu trúc mở và xảy ra rất nhanh so với quá trình mở cấu trúc enzyme. - Sự khá bền nhiệt của BAA cho phép thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về tính chất động nhiệt học của quá trình vô hoạt. - Hình 1: Độ bền nhiệt của BAA ở 0.4mg/mL trong dung dịch đệm 0.1M Tris/HCl, pH 8.6, t=10 phút. - của phương trình động nhiệt học của quá trình vô hoạt BAA trong thanh trùng nhiệt.. - Khảo sát ảnh hưởng của thành phần và pH của dung môi đến độ bền nhiệt và đặc tính của quá trình vô hoạt BAA. - Khi thay đổi dung môi của BAA theo bảng 1, kết quả cho thấy (Hình 2), khi xử lý nhiệt enzyme BAA ở nồng độ thấp (0.04 mg/mL) trong dung dịch đệm phosphate buffer (pH 7.0), BAA kém bền nhiệt nhất. - Đồng thời sự quá trình vô hoạt diễn ra theo 2 giai đoạn rõ rệt. - BAA ở nồng độ 0.04 mg/mL trong Tris/HCl buffer (không bổ sung CaCl 2 ) cho thấy khả năng bị vô hoạt do nhiệt trong khoảng nhiệt độ rộng từ 40 o C đến 110 o C và hoạt độ BAA giảm mạnh nhất tại 60 o C. - Tại 110 o C, hoạt độ của BAA ở điều kiện này hoàn toàn bị ức chế.. - BAA ở nồng độ cao (0.4 mg/mL trong dung dịch đệm Tris/HCl pH 8.6) bền nhiệt hơn so với cả hai trường hợp BAA nồng độ thấp (0.04 mg/mL) dung dịch đệm phosphate và Tris/HCl buffer pH 8.6. - Tuy nhiên, BAA ở nồng độ cao (0.4 mg/mL trong dung dịch đệm Tris/HCl pH 8.6) kém bền nhiệt hơn BAA ở nồng độ thấp trong dung dịch đệm có bổ sung CaCl 2 . - Sự vô hoạt do nhiệt của BAA ở điều kiện này xảy ra mạnh nhất trong khoảng nhiệt độ 70 o C to 90 o C và xảy ra trong một giai đoạn duy nhất. - Có nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tăng sự bền nhiệt của BAA. - Trong các dung môi không phân cực này BAA bền nhiệt hơn và quá trình vô hoạt xảy ra theo phương trình động nhiệt học bậc nhất (Saraiva et al., 1996). - Ngoài ra, sự có mặt của ion calcium trong dung dịch làm tăng sự bền nhiệt của α-amylase (Saboury, 2002. - Khảo sát đặc tính nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA (0.04 mg/mL) trong dung dịch đệm Tris/HCl có bổ sung CaCl 2 5 mM ở chế độ thanh trùng.. - Hình 2: Sự phụ thuộc của độ bền nhiệt của BAA đối với thành phần dung môi và pH 0.04 mg/mL trong đệm phosphate pH 7.0. - Quá trình vô hoạt BAA 0.4 mg/mL (trong Tris/HCl pH 8.6) xảy ra theo hai bước, do đó không thích hợp để phát triển thành TTI. - BAA (0.04 mg/mL) trong dung dịch đệm Tris/HCl có bổ sung CaCl 2 5 mM có độ bền nhiệt cao. - Theo khảo sát ban đầu quá trình vô hoạt BAA ở điều kiện này xảy ra theo một bước. - Vì vậy thí nghiệm khảo sát đặc tính nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA (0.04 mg/mL) trong dung dịch đệm Tris/HCl có bổ sung CaCl 2 5 mM được thực hiện.. - Khảo sát đặc tính nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA (0.04 mg/mL) trong dung dịch đệm 0.1 M Tris/HCl có bổ sung CaCl 2 5 mM ở chế độ thanh trùng đẳng nhiệt.. - Quá trình vô hoạt của BAA ở điều kiện này được thực hiện ở khoảng nhiệt độ từ 72.5 o C – 95 o C. - Các phương trình động học mô tả các quá trình vô hoạt bậc 1, từng phần và song song được kiểm tra dựa trên kết quả hoạt độ BAA đo được bằng phương pháp quang phổ kết hợp các phương trình . - Hoạt tính sau khi xử lý nhiệt của BAA ở điều kiện này được thể hiện trong hình 3.. - Trong đó hoạt độ của BAA giảm theo thời gian trong khoảng nhiệt độ 72.5 to 75 o C. - Hoạt độ của BAA giảm càng nhanh khi tăng nhiệt độ xử lý nhiệt. - Kiểm tra phương trình nhiệt động học mô tả quá trình vô hoạt cho thấy phương trình phản ứng vô hoạt bậc nhất mô tả đúng nhất quá trình vô hoạt BAA (0.04 mg/mL trong dung dịch đệm 0.1 M Tris/HCl có bổ sung CaCl 2 5 mM) ở khoảng nhiệt độ thí nghiệm. - Hình 4 thể hiện sự tương thích giữa hoạt tính enzyme đo được bằng phương pháp quang phổ và hoạt tính enzyme BAA ước lượng khi sử dụng phân tích hồi qui không tuyến tính đối với phương trình vô hoạt bậc nhất kết hợp phương trình Arrhenius. - (1997) khi nghiên cứu động nhiệt học của sự vô hoạt enzyme BAA nồng độ 200 mg/mL (trong Tris, pH 8.6) ở nhiệt độ 77 đến 84 o C. - Sự vô hoạt theo phương trình bậc nhất của được nhận thấy ở nghiên cứu của Lee et al. - Các thông số nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA được ước lượng bằng phân tích hồi qui không tuyến tính. - Giá trị hằng số tốc độ phản ứng k tăng theo nhiệt độ. - Cả hai phương trình Arrhenius (3) và TDT (4) đều lần lượt mô tả tốt sự phụ thuộc vào nhiệt độ của hằng số tốc độ phản ứng vô hoạt và thời gian ức chế thập phân.. - Hằng số tốc độ phản ứng tham chiếu, giá trị D ref và năng lượng hoạt hóa cho phản ứng vô hoạt được ước lượng. - (1997) đã tìm dược giá trị D 80 °C phút) khi xử lý đẳng nhiệt BAA (ở 200 mg/mL, trong dung dịch Tris, pH 8.6) trong khoảng nhiệt độ 77- 84 o C. - Điều này có thể giải thích dựa trên sự bền nhiệt của BAA ở nồng độ cao. - Các kết quả trên cho thấy, BAA có khả năng được vận dụng như là một TTI trong quá trình thanh trùng. - Tuy nhiên, để ứng dụng trong thực tế, các thông số của phương trình nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA ước lượng ở điều kiện đẳng nhiệt phải được kiểm chứng dưới điều kiện bất đẳng nhiệt.. - Khảo sát đặc tính nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA (0.04 mg/mL trong dung dịch đệm 0.1 M Tris/HCl, bổ sung CaCl 2 5 mM) ở chế độ thanh trùng bất đẳng nhiệt.. - Sự kiểm chứng đặc tính của quá trình vô hoạt BAA được thực hiện ở nhiệt độ 75 o C, 80 o C, 85 o C. - Kết quả cho thấy, tương quan nhiệt độ - thời gian của quá trình vô hoạt BAA dưới điều kiện bất đẳng nhiệt có đồ thị tương tự như ở chế độ đẳng nhiệt. - Các thông số nhiệt động học k ref và E a ước lượng từ thí nghiệm trong điều kiện đẳng nhiệt kết hợp với tương quan nhiệt độ - thời gian đo được bằng cặp nhiệt điện được sử dụng để tính toán hoạt độ của BAA sau khi xử lý nhiệt (T ref = 80 o C).. - Vì vậy có thể kế luận phương trình nhiệt động lực học của quá trình vô hoạt BAA (0.04 mg/mL. - Hình 3: Sự vô hoạt đẳng nhiệt của BAA (0.04 mg/mL trong dung dịch đệm 0.1M Tris/HCl. - Hình 4: Sự tương thích của phương trình vô hoạt bậc nhất của BAA kết hợp với phương trình Arrhenius (phân tích hồi qui không tuyến tính). - trong dung dịch 0.1 M Tris/HCl, bổ sung CaCl 2 5 mM) dưới điều kiện đẳng nhiệt được kiểm chứng đúng dưới diều kiện xử lý bất đẳng nhiệt.. - Các thông số nhiệt động học của quá trình vô hoạt BAA được ước lượng dưới điều kiện xử lý không đẳng nhiệt bằng cách sử dụng phân tích hồi qui không tuyến tính (non-linear regression) kết hợp các phương trình Arrhenius và TDT. - Nhiệt độ tham chiếu T ref =80 o C. - Tuy nhiên, ở khía cạnh an toàn thực phẩm, giá tri z của BAA trong điều kiện thí nghiệm nằm ngoài phạm vi giá trị z của vi sinh vật thường sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình thanh trùng (z= 5 - 12 o C). - Trong nghiên cứu phát triển hệ thống chỉ thị sinh học cho quá trình thanh trùng, BAA (0.04 mg/mL trong dung dịch đệm 0.1 M Tris/HCl, bổ sung CaCl 2 5 mM) cho thấy khả năng có thể ứng dụng để đánh giá ảnh hưởng của quá trình thanh trùng. - BAA ở điều kiện này có đặc tính nhiệt động lực học của phản ứng vô hoạt theo phương trình của phản ứng bậc nhất. - Tuy nhiên, nằm ngoài phạm vi của các vi sinh vật mục tiêu của quá trình thanh trùng. - Do đó, để phát triển hoàn chỉnh một hệ thống TTI, đánh giá tốt quá trình thanh trùng, cần nghiên cứu hiệu chỉnh dung dịch enzyme để giá trị z nằm trong phạm vi sử dụng hoặc nghiên cứu phát triển hệ thống TTI đa thành phần.