- SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG MEN THUẦN TRONG LÊN MEN RƯỢU NẾP THAN. - Amylomyces rouxii và Saccharomyces cerevisiae được sử dụng làm giống chủng cho qui trình sản xuất men rượu thuần. - Tỉ lệ gồm 1,5% bột mốc và 0,4% bột men là thích hợp cho qui trình sản xuất rượu nếp than. - Thành phần là bột gạo, hỗn hợp bột gạo và bột khoai mì thích hợp làm môi trường để sản xuất men rượu thuần gồm tổ hợp mốc và men. - Hoạt tính men rượu có chiều hướng giảm trong quá trình lên men rượu sau thời gian tồn trữ, tuy vậy nồng độ cồn đạt được khi sử dụng men rượu sau 12 tháng tồn trữ vẫn còn thể hiện khá cao (16,2 % (v/v) ở 20 o C). - Từ khóa: Amylomyces rouxii, Saccharomyces cerevisiae, men rượu thuần 1 GIỚI THIỆU. - Dung et al., 2007), là một trong những yếu tố chủ yếu có vai trò rất quan trọng trong quá trình lên men rượu và ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng sản phẩm cuối cùng. - Việc sử dụng nguồn giống vi sinh vật thuần chủng có hoạt tính cao và có tính ổn định trong quá trình lên men rượu là rất cần thiết. - Dung et al., 2006), nghiên cứu điều kiện sản xuất và sử dụng men giống thuần, đánh giá tính ổn định của men giống sau thời gian tồn trữ, và phân lập định danh vi khuẩn lây nhiễm trong quá trình sản xuất men rượu thuần.. - 2.2.1 Xác định hoạt tính A. - Xác định hoạt tính A. - rouxii trong quá trình đường hóa từ gạo nếp than và hoạt tính S. - cerevisiae trong quá trình lên men rượu từ dịch đường hóa.. - 2.2.2 Sản xuất bột mốc thuần từ nấm mốc A. - Khảo sát tỉ lệ sử dụng bột mốc: sau khi chọn môi trường nuôi và thời gian ủ mốc thích hợp, tiến hành thí nghiệm thử tỉ lệ sử dụng bột mốc. - 1,5% và 2% bột mốc so với cơ chất và có 3 lần lặp lại.. - Hoạt tính bột mốc được xác định trong quá trình đường hóa từ gạo nếp than.. - 2.2.3 Sản xuất bột men thuần từ nấm men S. - Sinh khối nấm men được nuôi trong bình lên men 20l chứa môi trường PG trong 16 giờ. - Tiến hành thử tỉ lệ sử dụng bột men cho quá trình lên men rượu từ dịch đường hóa gạo nếp than ở 20 o Brix. - Thu hoạch dịch lên men và phân tích các chỉ tiêu.. - 2.2.4 Xác định tỉ lệ phối hợp bột mốc và bột men trong sản xuất rượu nếp than Thí nghiệm gồm 2 nhân tố 3 mức độ và 3 lần lặp lại. - Tỉ lệ so với cơ chất là bột mốc (1%. - Thu dịch lên men và tiến hành phân tích các chỉ tiêu.. - 2.2.5 Sản xuất men rượu thuần gồm tổ hợp nấm mốc và nấm men. - Qui trình dựa trên phương pháp cổ truyền sản xuất viên men rượu và được cải tiến ở một số bước thích hợp dựa vào những kết quả tối ưu đạt được trong các thử nghiệm. - Thí nghiệm thử tìm ra cơ chất thích hợp và điều kiện chuẩn bị đơn giản để có thể sử dụng trong sản xuất men rượu với số lượng lớn, có 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại.. - Men rượu thuần sau thời gian tồn trữ là 3, 6, 9 và 12 tháng trong bọc PP, ép miệng, ở 4 o C được xác định hoạt tính trong quá trình lên men rượu.. - Bột mốc sau khi được sản xuất và tồn trữ trong bọc PP ép miệng, ở nhiệt độ môi trường xung quanh sau 3, 6 và 9 tháng được xác định mật số bào tử và hoạt tính trong quá trình đường hóa.. - Bột men sau khi được sản xuất và tồn trữ, lấy mẫu sau 1, 3 và 5 tháng để xác định mật số và hoạt tính trong quá trình lên men rượu. - Khả năng lên men rượu của nấm men: sự sinh gas (bọt khí trong waterlock), đo pH, xác định glucoz, xác định rượu etylic bằng chưng cất.. - 3.1 Hoạt tính của A. - Điều này cho thấy nấm men có khả năng lên men mạnh và nhanh, biến đổi gần như hoàn toàn lượng glucoz tiêu thụ thành etanol.. - Việc xác định hoạt tính đường hóa cao của nấm mốc và khả năng lên men mạnh của nấm men là rất quan trọng, cần phải thực hiện mỗi khi bắt đầu sử dụng làm nguồn giống chủng cho quá trình sản xuất, vì đây là khâu đầu tiên trong quá trình sản xuất, trong khi vi sinh vật rất nhạy, dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy và qua quá trình tồn trữ.. - 3.2 Sản xuất bột mốc thuần. - 3.2.1 Môi trường sản xuất bột mốc. - Do yêu cầu thực tế của các đơn vị cơ sở phối hợp để thử nghiệm, có trường hợp khi chỉ sử dụng nấm mốc để thử khả năng đường hóa trong khi có trường hợp chỉ cần sử dụng nấm men để thử khả năng lên men rượu, vì vậy bột mốc và bột men được thử nghiệm sản xuất riêng biệt nhau. - Thử nghiệm sản xuất bột mốc từ 5 loại môi trường khác nhau, để tìm ra cơ chất thích hợp cho nấm mốc phát triển. - Kết quả mật số bào tử nấm mốc được xác định bằng phương pháp đếm huỳnh quang và khả năng đường hóa của bột mốc trên khối nếp hấp ở Bảng 1. - Kết quả thống kê cho thấy sự khác biệt về hoạt tính của 5 loại bột mốc dựa trên thể tích dịch rỉ và hàm lượng glucoz sinh ra trong dịch rỉ sau giai đoạn ủ mốc có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. - Log bào tử/g bột mốc. - 3.2.2 Xác định thời gian ủ thích hợp để sản xuất bột mốc. - Lượng glucoz sinh ra giữa ủ 6 ngày và 7 ngày khác biệt không ý nghĩa, do đó nghiệm thức 6 ngày là thời gian ủ thích hợp thích để sản xuất bột mốc.. - Bảng 2: Hoạt tính đường hóa của bột mốc qua các thời gian ủ Nghiệm. - Độ ẩm bột mốc (%w/v). - 3.2.3 Khảo sát tỉ lệ sử dụng bột mốc. - Lượng glucoz sinh ra trong dịch rỉ từ khối nếp hấp ở nghiệm thức sử dụng 0,5% bột mốc có giá trị thấp nhất, kế đến là nghiệm thức sử dụng 1,0% bột mốc. - Ở hai nghiệm thức sử dụng 1,5% và 2% bột mốc có lượng glucoz trong dịch rỉ khác biệt không ý nghĩa. - Như vậy với tỉ lệ bột mốc sử dụng thấp hơn nhưng vẫn cho hàm lượng glucoz trong dịch rỉ cao, cho thấy tỉ lệ sử dụng 1,5% bột mốc là thích hợp để sử dụng cho quá trình đường hóa.. - Tỉ lệ bột mốc. - 3.3 Sản xuất bột men thuần và khảo sát tỉ lệ sử dụng bột men. - Bột men được sản xuất theo yêu cầu thực tế của một số cơ sở đã có sẵn dịch rỉ đường và chỉ cần nguồn giống chủng là nấm men để thực hiện quá trình lên men rượu. - Khả năng lên men rượu của bột men qua các tỉ lệ sử dụng khác nhau được trình bày trong Bảng 4. - Kết quả cho thấy trừ nghiệm thức sử dụng 0,2% bột men thì sự lên men diễn ra yếu và chậm hơn, còn ở 3 nghiệm thức còn lại bọt khí CO 2 sinh ra nhiều, sự lên men diễn ra mạnh mẽ và nhanh chóng. - Độ pH của dịch sau lên men (4,5) thấp hơn. - so với trước khi lên men, đây là do trong quá trình chuyển hoá đường thành rượu, nấm men đã phân giải đường thành các sản phẩm trung gian như các axit hữu cơ, làm giảm pH của dịch lên men.. - Kết quả thống kê cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về khả năng lên men ở bốn tỉ lệ sử dụng dựa trên lượng glucoz và độ cồn trong dịch sau lên men, xác định được tỉ lệ 0,4% bột men là thích hợp sử dụng cho quá trình lên men rượu dịch đường của gạo nếp than.. - Bảng 4: Khả năng lên men của bột men qua các tỉ lệ sử dụng Nghiệm. - Tỉ lệ Bột men. - Sau lên men. - 3.4 Xác định tỉ lệ sử dụng phối hợp bột mốc và bột men. - Quá trình lên men rượu gồm hai giai đoạn chủ yếu: giai đoạn nấm mốc tạo dịch đường lên men được từ nguồn nguyên liệu tinh bột và nấm men chuyển hoá đường lên men thành cồn. - Thí nghiệm nhằm chọn ra tỉ lệ phối hợp bột mốc và bột men tối ưu ứng dụng cho quá trình lên men rượu. - Kết quả cho thấy ở cùng một tỉ lệ chủng bột mốc, glucoz trong dịch sau lên men ở các nghiệm thức khi chủng 0,2% bột men cao hơn và etanol thấp hơn so với khi chủng 0,4% và 0,8%. - Ở cùng một tỉ lệ chủng bột men với các tỉ lệ chủng bột mốc khác nhau, glucoz và etanol trong dịch sau lên men có sự khác biệt. - Các nghiệm thức sử dụng tỉ lệ bột mốc 1,5% và 2%. - cho etanol cao hơn sử dụng 1,0% bột mốc. - Điều này có thể giải thích với hoạt tính mạnh, nấm men có khả năng lên men gần như tối đa lượng đường trong dịch rỉ, do đó hàm lượng đường cao sẽ tạo ra hàm lượng etanol cao. - bột mốc và 0,4% bột men được chọn là mức độ chủng tối ưu cho quá trình sản xuất rượu nếp than (Bảng 5).. - 3.5 Môi trường sản xuất men rượu thuần gồm tổ hợp nấm mốc và nấm men Hoạt tính men rượu sản xuất từ các môi trường khác nhau được xác định thông qua khả năng đường hóa (Bảng 6) và rượu hóa (Bảng 7) của quá trình lên men rượu từ gạo nếp than.. - Bảng 5: Các chỉ tiêu về lên men khi sử dụng các tỉ lệ phối trộn bột mốc và bột men. - Tỉ lệ bột men. - Sau lên men A1B1. - Bảng 6: Khả năng đường hoá của men rượu thuần ở các nghiệm thức môi trường Nghiệ. - Giá trị pH trong khoảng thể hiện quá trình lên men diễn ra bình thường ở các nghiệm thức. - Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men rượu, bọt khí sinh ra rất nhiều, điều này chứng tỏ hoạt lực của nấm men rất mạnh, có khả năng chuyển hóa đường thành rượu tốt, đặc biệt ở các nghiệm thức 1, 2 và 5. - Glucoz trong dịch sau khi lên men còn rất ít (0,03%w/v) và kết quả độ cồn tạo ra cho thấy hiệu suất lên men rượu của nấm men là rất cao.. - Bảng 7: Khả năng lên men rượu của men rượu thuần ở các nghiệm thức môi trường Nghiệm. - 3.6 Tính ổn định của men rượu thuần qua quá trình tồn trữ 3.6.1 Hoạt tính của bột mốc sau thời gian tồn trữ. - Sau thời gian tồn trữ bột mốc trong bọc PP ép miệng và bảo quản ở nhiệt độ môi trường xung quanh, kết quả phân tích cho thấy mật số bào tử giảm nhẹ nhưng vẫn duy trì ở mức 10 6 bào tử/gam bột mốc. - Độ ẩm bột mốc tăng theo thời gian tồn trữ và có mối tương quan nghịch giữa độ ẩm bột mốc và hoạt tính. - Bột mốc có độ ẩm thấp sẽ có hoạt tính cao và ngược lại. - Hàm lượng glucoz trong dịch rỉ của bột mốc sau 3 tháng tồn trữ (25,3%w/v) không khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với trước khi tồn trữ (25,8%w/v), nhưng glucoz ở nghiệm thức sau 6 tháng (23%w/v) và 9 tháng (21%w/v) tồn trữ giảm có ý nghĩa so với trước khi tồn trữ. - Tuy vậy qua đây kết quả cho thấy hoạt tính đường hoá của nấm mốc trong bột mốc là khá ổn định sau một thời gian dài tồn trữ ở điều kiện môi trường xung quanh.. - 3.6.2 Hoạt tính của bột men sau thời gian tồn trữ. - Hoạt tính của bột men sau 1, 3 và 5 tháng tồn trữ được đánh giá qua quá trình lên men rượu từ dịch đường hóa nếp than (Bảng 8). - Ở bột men trước khi tồn trữ hàm lượng etanol của dịch lên men là 11,5 %v/v.. - Tuy vậy bột men trữ trong bọc PP ép miệng trữ ở môi trường xung quanh vẫn có khả năng lên men tốt sau 3 tháng với độ cồn 9,34 (%v/v). - Bảng 8: Hoạt tính bột men sau thời gian tồn trữ Nghiệm. - 3.6.3 Hoạt tính men rượu thuần qua thời gian tồn trữ. - Thí nghiệm này sử dụng men rượu thuần đã được sản xuất và tồn trữ trong bọc PP, ép miệng và bảo quản ở 4 o C. - Kết quả cho thấy khi sử dụng men rượu thuần qua quá trình tồn trữ (3, 6, 9 và 12 tháng) để tiến hành lên men rượu từ khối nếp hấp, hàm lượng cồn sinh ra có giảm theo thời gian tồn trữ nhưng vẫn còn khá cao (Hình 1). - cerevisiae trong men rượu thuần thể hiện được tính ổn định trong hoạt tính đường hóa và khả năng lên men rượu sau một thời gian dài tồn trữ (12 tháng).. - Thời gian tồn trữ (tháng) Độ cồn ở 20oC (%v/v). - Hình 1: Hoạt tính của men rượu thuần qua thời gian tồn trữ. - 3.7 Phân lập và định danh vi khuẩn nhiễm trong quá trình sản xuất men rượu thuần. - Trong quá trình chuẩn bị men rượu thuần dù chỉ sử dụng nguồn giống thuần gồm tổ hợp nấm mốc và nấm men để chủng vào khối bột nhào, nhưng qua quá trình quan sát và đếm mật số vi sinh vật đã phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn. - phát triển mật số nhiều hơn nhanh chóng trong quá trình lên men sau đó. - Bắp mảnh và trấu là cơ chất thích hợp cho môi trường sản xuất bột mốc từ Amylomyces rouxii với thời gian ủ là 6 ngày. - Thành phần bột gạo và bột khoai mì thích hợp làm môi trường để sản xuất men rượu thuần gồm tổ hợp mốc và men. - Hoạt tính men rượu có chiều hướng giảm trong quá trình lên men rượu sau thời gian tồn trữ, tuy vậy nồng độ cồn đạt được khi sử dụng men rượu sau 12 tháng tồn trữ vẫn còn thể hiện khá cao